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目的:肝脏移植是各类终末期肝脏疾病唯一有效的治疗手段。然而,供体器官的短缺严重制约着肝移植手术的开展,每年有大量患者在等待供体的过程中死亡。为了解决供体器官短缺的问题,增加供体器官数量,许多肝移植中心开始关注并使用心脏死亡供体(Donation after cardiac death,DCD)。然而与脑死亡供体(Donation after brain death,DBD)相比,DCD在器官获取之前经历了额外的热缺血阶段,移植后会发生更为严重的缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion?injury,IRI),因此DCD受者术后发生诸如:移植物原发性无功能(primary non-function,PNF)以及缺血相关胆道疾病等严重并发症的风险更高。为了更好的利用DCD,如何对DCD进行保存和修复成为肝移植外科新兴的热点问题,并且有重要的意义。在肝脏移植的过程当中,供体器官难以避免的会经历缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion?injury,IRI),而严重的IRI被认为是引起移植术后移植物丧失的主要原因。对于肝脏移植而言,IRI的机制十分复杂,尚未被完全揭示,已知的主要机制包括:氧、氮自由基激活,细胞内钙离子超载,酸中毒,能量代谢障碍,炎性反应激活等。近年来有多篇研究表明,在肝脏移植过程中存在着多种炎性小体的激活,并与肝脏损伤的关系密切,但其具体的致伤机制尚不完全清楚。炎性小体是细胞内一种由多种蛋白质组成的复合体,其分类一般根据其包含的受体蛋白的类型进行划分,具有代表性的有:含有NOD样受体蛋白的NLRP家族炎性小体以及含有HIN200蛋白受体的AIM2炎性小体。NLRP3炎性小体是NLRP炎性小体家族中被研究的最为深入和广泛的一员,目前已经证明NLRP3炎性小体在多种自身免疫性疾病以及慢性炎症中都发挥着重要的作用,其已被广泛认可的作用机制是促进白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的成熟。同时已有研究证实,肝脏各类细胞内,在肝脏移植过程中尤其是移植术后都存在明显的NLRP3炎性小体激活并发挥损伤作用,但是其具体的致伤机制尚无明确完整的报道,有待深入研究。有报道证实,在冠心病动物模型中使用选择性的NLRP3炎性小体抑制剂MCC950治疗,可以明显改善冠心病动物的预后。受该实验结果的启发,NLRP3炎性小体是否可以作为治疗靶点,减轻肝脏IRI,从而改善DCD肝脏移植的预后具有重要的研究意义。低温机械灌注(hypothermic machine perfusion,HMP),是一种新型的肝脏保存技术,并认为可以部分修复损伤的DCD器官,改善DCD受者预后。因此HMP有取代以往传统冷保存(static cold storage,SCS)成为DCD供肝首选保存方式的趋势。但是HMP具体的保护机制尚不完全明确,HMP所采用的实施条件及参数,保存液的成分以及保存液添加剂的选用尚存在较大争议,需要大量的实验进行探索及验证。结合NLRP3炎性小体在肝脏IRI中的重要作用,为了推动HMP技术的发展,NLRP3炎性小体抑制剂MCC950是否适合作为灌注液添加剂加入到HMP的灌注液当中,从而提高HMP的保存效果具有重要的研究价值。因此,揭示NLRP3炎性小体在肝脏IRI过程中的损伤机制,并且研究NLRP3炎性小体是否可以作为治疗靶点,提高HMP这一新型技术对于DCD供肝的保存效果,是本研究的目的。研究方法:建立大鼠及小型猪原位肝脏移植模型:大鼠采用SD大鼠磁环双袖套法建立原位DCD肝移植模型,小型猪模型采用巴马小型猪DCD肝移植模型,供器官采用HMP进行保存。将SD大鼠随机分成四组:假手术组,肝移植组,MCC950组,IL-1Ra组,大鼠供肝热缺血开始前10min,MCC950组供体静脉注射MCC950,IL-1Ra组应用天然白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)拮抗剂IL-1Ra,MCC950组以及IL-1Ra组在供肝复灌流后分别静脉注射对应药物。术后根据肝脏酶学指标变化、HE染色、各炎性因子的表达情况以及TUNEL染色,评估肝组织IRI情况。并利用Western blot检测各组NLRP3炎性小体通路以及各凋亡相关蛋白及凋亡通路的表达情况。采用猪肝移植模型,结合低温机械灌注和MCC950。手术组分3组(每组6对),对照组(供肝采用常规HMP保存),术后组(供肝采用常规HMP保存并在单纯术后应用MCC950),灌注+术后组(供肝采用加入MCC950的灌注液保存,并在术后应用MCC950),术后根据肝脏酶学指标变化、HE染色、各炎性因子的表达情况以及TUNEL染色,评估肝组织IRI情况,并用MEAF评分预测受体长期预后。验证MCC950作为灌注液添加剂应用于HMP在大动物模型上的保护作用,判断是否可以转化为临床应用。结果:在大鼠及小型猪肝移植过程中,均有NLRP3炎性小体的激活,发挥损伤作用。大鼠DCD供肝热缺血前及肝脏再灌注后应用MCC950对于肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用,主要表现为MCC950组相比肝移植组肝脏酶学指标降低,IL-1β血清含量下降,HE染色损伤评分降低,凋亡减少。并且,MCC950对于肝脏缺血再灌注损伤的保护作用明显优于IL-1Ra,尤其是在减少肝细胞凋亡方面,表现为MCC950组术后肝细胞凋亡显著少于IL-1Ra组。检测凋亡相关蛋白发现,MCC950组相比IL-1Ra组线粒体凋亡相关蛋白细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)以及活化的半胱天冬酶3(Cleaved caspase 3,Cleaved CASP 3)细胞质内含量明显减少。进一步检测线粒体凋亡通路上游蛋白,发现活化Bid蛋白含量明显减少。在小型猪肝移植过程中,在低温机械灌注肝脏保存的灌注液中加入MCC950并在术后重复给药,其减轻IRI的效果优于普通低温机械灌注以及单纯术后应用MCC950。表现为:灌注+术后组相比另外两组肝脏酶学指标降低,IL-1β及TNF-α等促炎因子血清含量下降,HE染色损伤评分降低,凋亡减少。结论:大鼠DCD供肝缺血再灌注过程中,存在着NLRP3炎性小体激活,并发挥重要的损伤作用。其损伤机制除了经典的促进促炎因子IL-1β成熟,促进炎症反应外,还可以通过激活bid/tbid-Cyt C凋亡通路,引起肝细胞凋亡,从而引起一定程度的肝细胞损伤。在大鼠DCD供肝获取前,供体使用MCC950并于再灌注后重复用药可以有效抑制再灌注后NLRP3炎性小体激活,从而保护供肝,减轻IRI。为了更好的进行临床转化,将MCC950加入到机械灌注保存液当中并于术后重复用药,同样可以抑制NLRP3炎性小体激活,其效果优于单独术后用药。灌注液中加入MCC950提高了HMP对于DCD肝脏的修复效果,联合术后使用可以改善DCD受体预后。