伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aa)是牙周炎的主要致病菌，根据血清学实验结果不同可分为a、b、c、d、e5个血清型，其中b型是牙周病损中最常见、毒力最强的血清型。Aa及其产生的可溶性产物可通过破坏牙周组织、促进骨吸收和降低宿主免疫力等途径参与牙周炎的发生发展。以往的研究多偏重于细胞的活化与凋亡，尤其是通过各种方法去除Aa的可溶性产物，探讨菌体本身与宿主的关系。然而，细菌菌体本身直接侵入组织并不是引起牙周组织破坏的主要方式，除了急性坏死性溃疡性龈炎外，几乎没有发现细菌菌体直接侵入牙周组织，而由细菌产生的可溶性产物或是宿主对微生物的免疫反应才是导致牙周损伤的最主要机理。因而，本实验将Aa超声粉碎，过滤后利用其滤液与外周血中的PMNL共同培养，探讨细胞损伤后的形态学变化，从而进一步了解牙周组织的病理变化。本课题选取伴放线放线杆菌Y4（血清型为b型）为研究对象，主要方法有以下几步：1、培养伴放线放线杆菌：以富含胎牛血清的胰蛋白胨—大豆琼脂（TS琼脂）作为培养基培养伴放<WP=37>线放线杆菌，在37℃含10%CO2的条件下厌氧培养48小时，并用革兰氏染色及一系列生化反应鉴定该细菌并进行纯化。2、Aa的粉碎及过滤：将细菌用含蛋白酶抑制剂的裂解液处理，进行超声粉碎，超声功率60W，时间3min。用0.45μm滤膜过滤，弃沉淀，上清液冻干备用。3、从外周血中分离多形核白细胞：选取10名15～30岁的健康青少年，每人抽取20毫升静脉血，采用Percoll梯度离心方法分离多形核白细胞。4、Aa超声粉碎滤液刺激多形核白细胞：将分离出的多形核白细胞置于50毫升的培养瓶中，在37℃含5%CO2的孵箱中孵育0—60分钟，为了观测Aa可溶性产物对多形核白细胞的损伤情况，实验组是在PMNL中加入Aa超声粉碎滤液（浓度为100μg/ml），对照组是在含抗毒血清的PMNL中加入Aa超声粉碎滤液。 5、透射电子显微镜样品的制备和观察摄片：将上述组织经2.5%戊二醛前固定：1%锇酸后固定，乙醇系列脱水，Epon812环氧树脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片机半薄切片定位后做超薄切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，JEM-1200EX型透射电镜观察摄片。实验结果显示：实验组与对照组相比，脱粒的多形核白细胞数在20分钟、40分钟、60分钟三个时间点上表现出明显差异。在实验组中，20分钟时间点上脱粒的多形核白细胞数较较<WP=38>20分钟前明显增多。并且，两组在40分钟及60分钟时间点上将差异进一步扩大（20分钟实验组比对照组高出17.92%，40分钟和60分钟则分别为40.50%和45.34%）。由此证明Aa的超声滤液可引发外周血多形核白细胞脱粒，而且在作用后第20分钟出现对该细胞明显的破坏作用，这种作用有时间依赖性，在40分钟及60分钟持续加重。从形态学上观察可发现实验组与对照组细胞的变化在实验早期便呈现差异，透射电子显微镜观察实验组的多形核白细胞在Aa超声粉碎滤液作用仅1分钟时便出现细胞内颗粒向细胞周边靠近、移动的现象（图三、图四），在作用5分钟时，会发现实验组内细胞破裂，其颗粒伴随部分胞液脱出细胞外（图五），当然并非所有的多形核白细胞都在电镜下呈现明显的变化。而与此同时，对照组细胞的无明显变化，呈现多形核白细胞的正常形态（图二）。由于Aa的超声粉碎滤液中大多是细菌分泌的可溶性产物，加之细菌产生的可溶性产物是导致牙周组织破坏的最主要机理，因而利用Aa的超声粉碎滤液和外周血PMNL混合培养，能够准确的探讨该细菌对宿主牙周组织的破坏机制以及对它在牙周炎发生过程所起的作用予以恰当的定位。 <WP=39>Aa粉碎滤液可以破坏PMNL的完整性降低其粘附贴壁和趋化作用，使细胞不能穿越血管内皮，到达炎症部位吞噬细菌。因此通过本实验的研究我们认为Aa超声粉碎滤液可以诱导外周血多形核白细胞脱粒，降低宿主免疫功能，促进牙周炎的发展，由此为临床上牙周炎的鉴别诊断、治疗和预防提供重要的理论依据。