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研究背景:糖尿病（Diabetes mellitus,DM）是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病,其严重威胁着人们的健康并造成了巨大的社会负担。目前,全球糖尿病患病率高达10.5%（约有5.4亿人）,并且还有逐年增长的趋势。除了高患病率,糖尿病还可引起多种并发症。而皮肤伤口愈合延迟是糖尿病最常见的并发症。糖尿病患者皮肤厚度变薄并存在愈合能力受损,一旦发生创伤则会出现难愈性的伤口,进而导致慢性溃疡,严重者甚至需要截肢并有可能危及生命,严重影响着患者的健康与生活质量。如何促进糖尿病伤口愈合仍是临床上的热点和难点问题,而深入研究其愈合延迟的分子机制有助于探索发现新的治疗策略,具有重要的临床意义。伤口愈合是一个复杂的、动态变化的生物学过程,有多种组织细胞（包括成纤维细胞,内皮细胞以及角质细胞）、免疫细胞、可溶性介质及细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）共同参与。而基质细胞蛋白（Matricellular proteins,MCPs）是一组非结构性ECM,是沟通细胞和细胞外基质信号的桥梁,并且参与细胞的粘附、增殖、迁移、分化和信号传递等多种生物学过程。肾小管间质性肾炎抗原样蛋白1（Tubulointerstitial nephritis antigen-like 1,TINAGL1）是一种于2001年新发现,并在2007年被鉴定为MCPs的蛋白。有研究显示,正常皮肤伤口愈合中存在TINAGL1表达升高。然而,目前TINAGL1在糖尿病伤口愈合中的作用以及机制仍然不清楚。阐明糖尿病伤口愈合过程中TINAGL1的表达模式、调控机制和功能作用,有助于我们理解伤口愈合延迟的病理过程,并可为糖尿病伤口愈合的治疗提供新的策略和理论基础。研究目的:研究TINAGL1在糖尿病伤口愈合过程中的表达模式、调控机制和功能作用。研究方法:第一章:TINAGL1在糖尿病伤口愈合中的表达模式研究1.采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）、ELISA以及Western blot（WB）实验技术检测非糖尿病与糖尿病患者伤口组织中TINAGL1的表达情况。2.构建正常小鼠皮肤伤口愈合模型,并采用q RT-PCR、ELISA以及WB实验技术检测TINAGL1在小鼠伤口愈合过程中的动态变化。3.构建糖尿病小鼠伤口愈合模型,并通过q RT-PCR、ELISA以及WB实验技术检测TINAGL1在糖尿病小鼠伤口组织中的表达情况。4.采用q RT-PCR和WB实验技术检测暴露于高糖（High glucose,HG）环境下离体皮肤创面肉芽组织中TINAGL1的表达变化。第二章:TINAGL1在糖尿病伤口愈合中的调控机制研究1.采用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色技术分析伤口组织中TINAGL1的表达与细胞来源。2.RNA-seq分析HG刺激成纤维细胞后关键MCPs的表达变化。3.采用q RT-PCR和WB实验技术检测HG对成纤维细胞内TINAGL1表达的影响。4.采用q RT-PCR和WB实验技术检测HG对血管内皮细胞内TINAGL1表达的影响。5.基于RNA-seq实验结果分析HG可能扰乱的信号通路。采用信号通路阻断剂预处理NIH3T3细胞后,进行HG刺激,通过q RT-PCR检测TINAGL1 m RNA表达水平,WB检测TINAGL1蛋白及关键信号蛋白的磷酸化表达水平。第三章:TINAGL1在糖尿病伤口愈合过程中的功能作用以及机制研究1.外源性应用重组小鼠TINAGL1（rm TINAGL1）蛋白于糖尿病小鼠皮肤伤口组织,并在不同时间点记录伤口的情况和收集规定时间点的伤口组织。通过计算伤口愈合率,愈合曲线下面积（Area Under Curve,AUC）,以及绘制伤口融合图像,分析rm TINAGL1对糖尿病伤口愈合的影响。2.采用H＆E染色分析TINAGL1对糖尿病小鼠皮肤伤口肉芽组织的影响。3.采用马松（Masson）染色和q RT-PCR技术检测TINAGL1对糖尿病小鼠皮肤伤口胶原沉积的影响。4.采用IHC和q RT-PCR检测TINAGL1对糖尿病小鼠皮肤伤口血管生成和促血管生成相关因子表达的影响。5.采用q RT-PCR实验技术检测TINAGL1对成纤维细胞胶原相关基因和血管生成相关因子表达的影响。研究结果:第一章:TINAGL1在糖尿病伤口愈合中的表达模式研究1.相比较非糖尿病患者伤口组织,糖尿病患者伤口组织中TINAGL1的表达水平显著降低。2.在正常小鼠伤口愈合过程中,TINAGL1的表达呈动态变化,且在第9天达到峰值。3.成功构建糖尿病小鼠伤口愈合模型,相较对照组小鼠,糖尿病小鼠伤口愈合明显延迟,并且组织中的TINAGL1表达明显降低。4.相比较暴露于正糖（Normal glucose,NG）中的肉芽组织,暴露于HG中的伤口肉芽组织中TINAGL1的表达明显降低。第二章:TINAGL1在糖尿病伤口愈合中的调控机制研究1.IHC结果显示,相较对照组,糖尿病小鼠伤口组织内TINAGL1的表达显著降低,并且TINAGL1主要表达于成纤维细胞。2.RNA-seq结果显示,HG刺激NIH3T3细胞后,细胞内多个重要MCPs基因的表达发生改变,并且TINAGL1表达显著降低。3.q RT-PCR以及WB结果显示,相较对照组,HG刺激NIH3T3细胞内TINAGL1表达水平降低。4.HG不影响HMEC-1细胞内TINAGL1的表达。5.HG刺激可以干扰成纤维细胞内的多条信号通路。而JNK inhibitor II信号通路阻断剂可明显改善HG对成纤维细胞中TINAGL1表达的抑制。第三章:TINAGL1在糖尿病伤口愈合中的功能作用以及机制研究1.与对照组相比,rm TINAGL1组糖尿病小鼠皮肤伤口创面明显缩小,伤口愈合进程明显加快。2.相较对照组,rm TINAGL1组肉芽组织面积显著增加。3.相较对照组,rm TINAGL1组创面胶原沉积显著增多。同时,rm TINAGL1组伤口组织中的胶原相关基因（Col1a1、Col3a1）表达显著上调。4.相较对照组,rm TINAGL1组CD34+细胞/新生血管数量明显增加,且创面组织中Vegfa表达明显升高,而Pdgfrb,Vegfr-2和Vegfr-3的表达两组间没有差异。5.rm TINAGL1刺激成纤维细胞后,成纤维细胞内Col1a1、Col3a1表达上调,并且Vegfa表达显著升高。研究结论:1.TINAGL1在糖尿病（人和小鼠）皮肤伤口组织中表达下降。2.HG通过激活JNK信号通路抑制成纤维细胞中TINAGL1表达。3.外源性TINAGL1介导伤口肉芽组织形成进而促进糖尿病皮肤伤口愈合。