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肿瘤是严重威胁人类健康的杀手之一,其发生率和死亡率呈逐年上升趋势,其治疗仍然面临着巨大的挑战。最近几年,随着肿瘤免疫学基础研究和转化医学研究的不断深入,以CAR-T、免疫检查点抑制剂和双特异性抗体为代表的肿瘤免疫治疗技术为肿瘤的治疗带来了变革性的进展,肿瘤免疫治疗被学者们认为是继手术、放疗和化疗之后的第四种治疗手段。肝癌和小细胞肺癌（Small cell lung cancer,SCLC）是两种恶性程度高、临床治疗效果差的实体肿瘤类型。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是肝癌的主要亚型,占所有肝癌的85%左右,其发生率和死亡率在所有肿瘤类型中分别排第六和第四,全球每年有超过70万人死于肝癌,而其中一半以上的肝癌患者发生在中国。截至目前,肝癌并没有很有效的治疗方案,临床上肝癌一线化疗药物索拉非尼和乐伐替尼对患者有一定的效果,但往往后期会产生很强的耐药性。与肝癌的强烈耐药性相似,小细胞肺癌是肺癌中最致命和侵略性极强的亚型,约占所有肺癌15%,具有高度耐药和极易复发等特征。临床上对小细胞肺癌患者大多采取放疗和化疗,但是由于小细胞肺癌患者复发率极高,导致治疗效果不佳。无论CAR-T还是双特异抗体免疫治疗都需要肿瘤特异性的标志物。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican 3,GPC3）蛋白和δ样蛋白3（Delta-like ligand 3,DLL3）分别是肝癌和小细胞肺癌免疫治疗的肿瘤标志物。GPC3属于硫酸乙酰肝素类蛋白聚糖家族,在HCC中高表达,而在正常组织中不表达。GPC3的两个代表性抗体HN3和h YP7是肝癌免疫治疗研究的理想抗体,其中h YP7抗体识别GPC3蛋白C末端,HN3抗体识别GPC3的N端功能区域,这两个抗体对GPC3都有很强的亲和力。在小细胞肺癌方面,DLL3是小细胞肺癌免疫治疗理想的靶标蛋白。DLL3是Notch受体的配体,通常在小细胞肺癌细胞表面高表达,而在正常组织中不表达。抗体药物偶联物（Antibody-drug conjugate,ADC）Rova-T中的SC16抗体能高亲和力地结合DLL3,在Rova-T杀伤小细胞肺癌过程中发挥重要靶向作用。本研究使用靶向GPC3的h YP7抗体和HN3抗体以及靶向DLL3的SC16突变体抗体SC16.15制备了一系列T细胞型双特异性抗体,通过体外测试和NSG小鼠体内测试来评估T细胞型双特异性抗体的抗肿瘤活性。研究结果如下:（1）GPC3蛋白在G1细胞（超表达GPC3的细胞稳转株）以及在肝癌细胞系Hep G2,Hep3B和Huh7中高表达。同时添加GPC3重组蛋白能够很好的抑制肝癌细胞系的增殖,也说明GPC3蛋白是肝癌细胞的功能性蛋白。（2）以HN3抗体和h YP7抗体为基础,采用三种双特异性抗体结构knob-intohole,sc Fv-sc Fv-h Fc和sc Fv-h Fc-sc Fv,构建了六种GPC3/CD3双特异性抗体（HN3-KH,h YP7-KH,HN3-OKT3-h Fc,h YP7-OKT3-h Fc,HN3-h Fc-OKT3和h YP7-h Fc-OKT3）,酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）实验表明六种双特异性抗体与GPC3蛋白具有高亲和力,流式细胞术再次证明六种双特异性抗体与G1和HCC细胞系具有很强的结合能力,同时双特异性抗体与CD3阳性细胞Jurkat和人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）均有效结合。（3）细胞杀伤实验表明,在未激活的人PBMC细胞与HCC细胞比例为20:1以及激活的人PBMC细胞与HCC细胞比例为2:1的情况下,六种GPC3/CD3双特异性抗体都展现出对GPC3阳性细胞很强的杀伤活性。其中h YP7-OKT3-h Fc的活性最强,其次是h YP7-KH和HN3-KH,而h YP7-h Fc-OKT3,HN3-OKT3-h Fc和HN3-h Fc-OKT3活性较弱。（4）体内剂量爬坡实验表明GPC3/CD3双特异性抗体的最佳有效剂量为0.2mg/kg。六种GPC3/CD3双特异性抗体在移植瘤小鼠模型中都能有效的抑制肿瘤生长,且效果相似,其中h YP7-OKT3-h Fc效果略好。（5）以SC16.15抗体为基础,采用knob-into-hole,sc Fv-sc Fv-h Fc和sc Fv-h Fcsc Fv三种结构制备了三种DLL3/CD3双特异性抗体（SC16.15-KH,SC16.15-OKT3-h Fc,SC16.15-h Fc-OKT3）,流式细胞术检测发现三种DLL3/CD3双特异性抗体都能与超表达DLL3的A431（DLL3）细胞和小细胞肺癌细胞系H446相结合,同时与CD3阳性的人PBMC细胞特异结合。（6）三种DLL3/CD3双特异性抗体在体外小细胞肺癌细胞杀伤实验中展现出很强的杀伤活性,在H446移植瘤小鼠模型中同样能很好的抑制肿瘤生长,其中SC16.15-KH抗肿瘤活性最强。（7）双特异性抗体h YP7-OKT3-h Fc联合免疫检查点PD-1抗体在Hep G2移植瘤小鼠模型中具有微弱的增效作用,而SC16.15-KH联合PD-1抗体在H446移植瘤小鼠模型中能显著提高肿瘤抑制活性。（8）双特异性抗体h YP7-OKT3-h Fc和SC16.15-KH联合化疗药物伊立替康能够显著提升抗肿瘤活性。h YP7-OKT3-h Fc联合伊立替康可以使80%的G1移植瘤小鼠和20%的Hep3B移植瘤小鼠短暂性地消除瘤体。SC16.15-KH联合伊立替康可以使20%的H446移植瘤小鼠短暂性地消除瘤体。这些结果表明双特异性抗体联合化疗药物在肿瘤治疗中效果明显,值得未来在转化医学方面进行研究与探索。