氮是所有生物体不可缺少的组成元素,也是合成蛋白质和核酸等关键细胞化合物的必要物质。在农业生产中,为了提高作物产量,不得不大量使用氮肥,其中我国的氮肥施用量占全球氮肥施用量的35%。而氮肥的大量施用造成了大量化石能源的消耗以及大气、水体和土壤环境的严重污染。豆科植物根系能够与土壤中的固氮根瘤菌形成新的根器官-根瘤,并将空气中的氮气转化成可供植物吸收利用的铵态氮,从而减少对氮肥的需求。然而,该体系固氮性能的发挥和固氮效率的维持受多重因素限制,复杂多变的外界环境往往影响根瘤菌侵染、结瘤和根瘤发育,进而降低固氮效率。充分挖掘豆科植物与根瘤菌共生固氮的潜力,进一步提高结瘤和固氮效率,对于减少农业不合理投入,保障粮食安全,促进农业可持续发展具有重要意义。植物根际促生菌（PGPR）是一类定殖于植物根际的细菌,能够通过直接或间接的生物学机制,促进植物生长并保证植株健康,如溶解磷和必需营养元素,促进养分吸收,产生植物激素,诱导植物增强抗性以及抑制病原微生物的生长等。根际促生菌模式菌株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）GB03能显著提高拟南芥、棉花、小麦、小花碱茅、黑麦草等多种植物的生长和抗逆性。已有研究对GB03与模式植物拟南芥的互作机制进行了深入的研究,从挥发物成分分析、促生作用机理、信号转导途径、菌株全基因组测序、抗逆作用机理以及对植株的养分调控作用方面做了大量的工作。例如,GB03可通过上调生长素合成和运输相关基因的表达促进生长素由叶片向根部运输,从而促进拟南芥植株的生长。同时已有报道表明GB03能够通过触发植物挥发物的释放,影响相邻植物的根际微生物群落。我们课题组的前期研究发现,菌株GB03能促进豆科植物白三叶和紫花苜蓿的生长并提高其抗逆性。目前,对于豆科植物结瘤固氮方面的研究多集中在根瘤菌与豆科植物互作机制方面,而有关根际促生菌调控豆科植物-根瘤菌共生固氮体系的相关机制少见报道,根际促生菌与根瘤菌之间的相互作用以及根际促生菌对共生固氮体系在形态学、细胞生物学与分子生物学层面的调控机制尚不明确。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上利用最早、栽培最广的一种优良豆科牧草,其营养价值丰富、产量高、品质好,素有“牧草之王”的美称。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是紫花苜蓿的一年生近缘种,广泛分布于世界各地,具有良好的分子遗传学和反向分子遗传学的分析研究体系,在豆科牧草基因功能研究方面具有不可替代性,特别是在豆科植物-根瘤菌共生固氮研究方面发挥着重要的作用。鉴于此,本研究以根际促生菌菌株GB03、苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）菌株Sm1021、紫花苜蓿和蒺藜苜蓿为实验材料,系统探究菌株GB03调控苜蓿结瘤固氮的机制,取得如下主要结果:1.平板对峙实验表明,根际促生菌菌株GB03与根瘤菌菌株Sm1021可以共存,不存在拮抗或抑制作用;利用梅里埃API鉴定系统对两种菌株的生理生化特征、酶活以及碳源利用水平进行鉴定,结果表明菌株GB03的生理生化特征与根瘤菌菌株Sm1021的差异较大;相较于根瘤菌菌株Sm1021,GB03表现出更高的底物代谢水平多样性以及更高的酶活性。细菌的代谢特性决定了细菌的适应性和代谢水平,是细菌定殖、增殖和适应特定外界环境的必要条件,代谢水平多样性高的菌群能够在复杂多变的环境中更好的存活和定殖。因此,我们推测菌株GB03与菌株Sm1021间良好的共存关系和资源利用、酶活的互补性有助于两种菌株充分利用环境中的资源,在土壤和植物根际高效的存活和定殖。2.与单一接种根瘤菌菌株Sm1021相比,共接种根际促生菌菌株GB03与根瘤菌菌株Sm1021 60天后,菌株GB03提高了根瘤菌-紫花苜蓿共生体系中紫花苜蓿的生物量、根系活力、叶绿素含量和光合效率;共接种在根瘤发育的早、中、晚三个时期（20dpi、40dpi、60dpi）均显著促进了紫花苜蓿根瘤数、有效根瘤数、有效根瘤占比及根瘤固氮酶活性;与单一接种Sm1021相比,共接种处理显著提高了紫花苜蓿根瘤数118.9%,129.2%和92.9%;显著提高根瘤固氮酶活性293.9%,493.6%和79.7%;共接种在根瘤发育的中期和晚期（40dpi和60dpi）显著提高了紫花苜蓿根和地上部碳、氮含量。因此,共接种处理对紫花苜蓿植株生长及光合作用的调控作用可能是由于共接种处理保证了植株体内积累充足的氮素,使植株更好地进行代谢和生长发育。与单一接种Sm1021相比,共接种处理改变了根瘤的形态结构,共接种处理植株的根瘤具有更多的分支,根瘤形态多呈掌状甚至珊瑚状。已有报道发现,这种根瘤形态的改变也出现在蒺藜苜蓿结瘤因子水解酶缺失突变体Mtnfh1中或接种过度分泌结瘤因子根瘤菌的蒺藜苜蓿中。因此我们推测,共接种引起的根瘤形态的改变可能是由于共接种调控了与结瘤因子相关的通路导致的。利用共聚焦显微镜对根瘤菌的定殖能力进行观测,结果发现,与单一接种Sm1021-GFP相比,共接种GB03和Sm1021-GFP后的根瘤内表现出更高的Sm1021-GFP定殖水平,根瘤固氮区内GFP荧光信号大幅增加,共接种处理的根瘤表现出更宽的根瘤分生区;利用透射电子显微镜对根瘤内部结构进行观测,发现共接种处理根瘤内部呈现出更多的类菌体结构和淀粉粒积累,更多的类菌体结构有助于根瘤固定更多的氮素。共生体内的类菌体固氮需要依赖豆科植物提供碳水化合物作为能量来源以及细菌细胞功能和固氮所必需的其他营养物质;作为储能单位的淀粉粒的积累则可为根瘤中根瘤菌固氮、类菌体分化提供更充足的能量。3.采用与上述生理实验相同的四种接种处理,分别处理10天（10 dpi）、30天（30 dpi）和55天（55 dpi）后提取紫花苜蓿根系总RNA进行转录组测序分析,通过组装和注释,共得到111,439条unigene,其中70.1%的unigene与蒺藜苜蓿的已知基因高度同源;与单一接种根瘤菌菌株Sm1021相比,共接种根际促生菌菌株GB03与根瘤菌菌株Sm1021调控了紫花苜蓿根中众多基因的表达,其中结瘤早期中调控的差异表达基因数目最多,达到了1514个,其中上调1037个,下调477个;结瘤中期共有163个差异表达基因,其中上调62个,下调101个;结瘤晚期共有806个差异表达基因,其中上调485个,下调321个;表明菌株GB03对结瘤过程的调控作用可能发生在结瘤早期。通过对上述1514个差异表达基因进行GO富集分析发现,涉及根瘤形态建成、共生关系、解剖结构、发育、器官发生、种间相互作用和结合等过程的基因被大量上调表达,对生物学过程的DAG分析发现差异基因最终富集在胚后形态发生和根瘤形态建成两个节点上,其中包括88个NCR肽相关基因以及与固氮相关的早期结瘤素、豆血红蛋白相关基因的表达受到了显著上调。在共生固氮关系中根瘤菌在根瘤中的分化并形成类菌体的过程中受到植株NCR肽的介导;早期结瘤素参与调控根瘤的早期形成和发育;而豆血红蛋白调节了根瘤中氧气的浓度,豆血红蛋白的含量和组分直接影响根瘤内固氮酶的活性。这些与结瘤固氮相关的关键基因的表达上调也与GB03提升紫花苜蓿结瘤固氮能力和根瘤菌定殖能力的实验结果一致。对紫花苜蓿结瘤早期共接种与单一接种间的差异表达基因进行了KEGG代谢途径富集分析,结果发现差异基因显著富集在与植物激素信号转导和黄酮类物质合成相关的代谢途径上;其中黄酮类物质生物合成途径的起始关键酶查尔酮合成酶（CHS）的多个基因上调表达;在与植物激素信号转导相关的代谢途径中与生长素、细胞分裂素等16个激素信号传导相关基因的表达受到调控。据此,我们推测GB03可能是通过调控早期的结瘤事件（包括类黄酮的合成和激素的信号传导）来调控结瘤的。4.为了验证上述推测,我们采用与紫花苜蓿亲缘关系最近、转录组注释同源性最高的豆科模式植物蒺藜苜蓿进行了后续的实验。研究发现,与单一接种Sm1021相比,共接种GB03和Sm1021的蒺藜苜蓿结瘤数同样显著的提升了48.2%。这与共接种提高紫花苜蓿结瘤数的结果相一致。已有研究表明,豆科植物要想形成能够固氮的根瘤需要根瘤菌侵染和根瘤原基形成两个事件同时发生,相互协调;当根瘤菌侵染和根瘤原基形成过程中的关键基因缺失时,就可能会出现不结瘤或是形成未被成功侵染不能够固氮的假瘤。为了探究GB03对蒺藜苜蓿结瘤的提升作用是否需要依赖于已知的结瘤过程中的通路来完成,我们利用蒺藜苜蓿-根瘤菌共生体结瘤过程中关键基因突变体进行了结瘤实验,结果发现GB03不能恢复蒺藜苜蓿结瘤因子受体缺失突变体nfp1的结瘤表型;共接种GB03和Sm1021后,蒺藜苜蓿细胞分裂素受体缺失突变体cre1、乙烯不敏感（超结瘤）突变体sickle的结瘤数与单一接种Sm1021无显著差异;同时,共接种处理不能改变苜蓿中华根瘤菌结瘤因子合成突变体nod C的完全不结瘤的表型,GB03与苜蓿中华根瘤菌胞外多糖合成突变菌株exo Y共接种后也并不能回补共生体根瘤的侵染定殖缺陷。这些结果表明GB03对蒺藜苜蓿结瘤的提升作用需要依赖于蒺藜苜蓿及根瘤菌共生固氮过程中的部分关键基因。利用共聚焦显微镜对蒺藜苜蓿结瘤早期结瘤关键事件进行观测,其中对结瘤早期根瘤原基的观测分析发现,接种3天后,GB03促进了蒺藜苜蓿共生体系中根瘤原基形成时皮层细胞的分裂,并显著提高了根瘤原基数目;与单一接种Sm1021相比,共接种处理的根瘤原基数目被提升了350%。同时,对蒺藜苜蓿结瘤早期根毛侵染事件观测发现,共接种4天后GB03的介入促进了蒺藜苜蓿根毛的分支及侵染线由表皮细胞向皮层细胞的延伸,并显著增加单位根瘤中的侵染线数目达125%。这些结果与GB03提高紫花苜蓿结瘤数和根瘤菌定殖效率的结果相吻合。细胞分裂素与生长素共同调控根瘤的早期发育,生长素和细胞分裂素的浓度和比例决定了细胞分裂的时间,影响了根瘤原基起始的皮层细胞的脱分化。生长素的分布、极性运输和信号转导对植物的器官发生及形态建成起重要调节作用。已有研究发现GB03可通过上调生长素合成和运输相关基因的表达,促进生长素由叶片向根部运输,从而促进拟南芥植株的生长。与单一接种Sm1021相比,共接种处理下接种点下部根段中的~3H-IAA含量降低了75.1%,表明共接种在接种点表现出了更强的生长素向顶运输抑制作用,使得更多的生长素积累在接种点位置。共接种GB03和Sm1021促进了植株生长素和细胞分裂素的积累,有助于促进结瘤早期皮层细胞的分裂和根瘤原基的形成,这与共接种调控紫花苜蓿结瘤早期激素信号转导的相关基因表达的结果相吻合。5.黄酮类物质作为植物的一类非常重要的次级代谢产物,在豆科植物-根瘤菌共生关系建立过程中发挥着重要的作用,包括诱导结瘤基因表达,调控生长素的极性运输,调控根瘤的形态建成等等。已有研究发现,当蒺藜苜蓿黄酮类物质合成相关的关键酶查尔酮合成酶CHS基因被干扰,接种根瘤菌对蒺藜苜蓿根系的局部生长素转运抑制作用也随之消失,植物也就不能够形成根瘤。在本研究中,通过黄酮类化合物代谢通路关键基因Mt CHS和Mt IFS干扰植株的结瘤实验发现,共接种处理不能恢复Mt CHS干扰植株的结瘤表型,表明GB03对蒺藜苜蓿共生体系结瘤的促进作用需要依赖查尔酮合成酶途径来完成,这与第4部分紫花苜蓿转录组分析结果相吻合。利用高分辨轨道阱液质联用质谱仪对蒺藜苜蓿根系组织、根系分泌物中与结瘤相关的45种黄酮类化合物含量进行测定,与前期共接种调控紫花苜蓿结瘤早期类黄酮的合成相关基因表达的结果相一致,GB03调控了结瘤早期蒺藜苜蓿关键黄酮类化合物的积累和分泌。与对照和单一接种根瘤菌相比,单一接种GB03降低了蒺藜苜蓿根系分泌物中的黄酮类化合物总量;与对照相比,单一接种GB03提升了蒺藜苜蓿根系组织中的黄酮类化合物总量。相较于单一接种根瘤菌,共接种降低了根系组织及根系分泌物中的黄酮类化合物总量,显著提升了根系分泌物中强结瘤基因的诱导子、生长素转运抑制子-二甲氧基查尔酮及柚皮素的含量,显著降低了根系分泌物中与防御反应、结瘤基因抑制作用相关的异黄酮（如美迪紫檀素、黄芪素、芒柄花素、染料木素、鹰嘴豆素A、芒柄花素等）的含量,从而进一步调节蒺藜苜蓿结瘤过程。综合以上GB03调控蒺藜苜蓿根瘤发育的相关研究结果,我们可以得到如下模型:GB03能够显著的调控蒺藜苜蓿的结瘤,包括调控侵染线和根瘤原基的形成,但这个促进效果还是需要依赖于蒺藜苜蓿早期结瘤相关基因参与;共接种上调了植株对细胞分裂素的响应,调控了黄酮类化合物的积累和分泌,进而增强了生长素转运的局部抑制,使得更多的生长素积累在接种点,诱导皮层细胞分裂和根瘤原基的形成;同时,共接种处理下强结瘤因子诱导子的二甲氧基查尔酮的分泌增多,结瘤基因抑制作用相关异黄酮分泌的降低,使得根瘤菌合成并分泌更多的结瘤因子,进一步的加强了侵染线的形成和根瘤原基的形成。以上研究结果从形态学、细胞生物学与分子生物学水平层面系统揭示了根际促生菌与根瘤菌之间的相互作用关系以及根际促生菌促进根瘤菌-苜蓿共生体系结瘤和提高固氮能力的机制,研究结果为科学高效利用根际促生菌资源提供了典型案例,为提升豆科牧草固氮潜力开辟了新的研究思路,为研发豆科植物高效固氮复合菌肥奠定了一定的理论基础。