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大肠癌为我国常见的发病率呈上升趋势的恶性肿瘤之一。对大肠癌(CRC)高发区大样本的流行病病因学研究提示外因在影响大肠癌的发生发展中起重要作用。环境生物因素约占大肠癌发生危险度的80％。微囊藻毒素污染和幽门螺杆菌(H.pylori)感染是两个重要的且为我国所特有环境生物因素。微囊藻毒素(microcystin，M)是一类环状多肽类肝毒素。业已证实微囊藻毒素对丝／苏氨酸蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1，PP1)和丝／苏氨酸蛋白磷酸酶2a(PP2a)具有强烈的抑制作用。而丝／苏氨酸蛋白磷酸酶2a在细胞信息通路传导中起重要功能。微囊藻毒素作为促癌剂已被证明具有促进实验动物肝癌的发生率，并且与人类肝癌的发生密切相关。近年来的动物实验和流行病学研究发现微囊藻毒素可能是大肠癌发生的一个重要外因。但微囊藻毒素在大肠癌发生中的作用机制尚不明确。Ames’试验、ouaR试验和人RSa细胞经微囊藻毒素处理后Ras基因发生突变等均提示微囊藻毒素可能具有致癌剂的作用，即在细胞基因组DNA中出现特异性的DNA加成物。然迄今尚无在细胞基因组DNA检测到相应的DNA加成物。另近年来发现定居于胃肠道细胞表面的某些细菌在肿瘤发生过程中起推波助澜的作用。H.pylori是最重要的细菌之一。我国是一个H.pylori感染率 浙江大学博士研究生学位论文较高的国家，且双P.y10rz’菌株ca酬的阳性率高达90%。双P.vjori感染与胃癌、胃猫膜相关性淋巴样淋巴瘤(MALT淋巴瘤)的关系密切。近年的研究也表明双P.刀orj感染尤其是cagA蛋白在大肠癌发生发展中可能起重要作用【”’‘，’。定植于宿主细胞表面的双P-刀ori菌通过其特异性的IV型分泌系统将CagA蛋白注入宿主细胞并出现酪氨酸磷酸化。含Sr。同源序列SHZ的酪氨酸磷酸酶(SHP一2)是磷酸化CagA蛋白的作用靶点并通过SHP一2、GrbZ强烈干扰细胞信息传导通路。因而具备了一个促癌剂的特征，即具有干扰细胞信息通路和促进细胞增殖的能力〔”，”，。然迄今尚无研究幽门螺杆菌CagA蛋白在胃肠上皮细胞突变中作用的报道。大肠癌的发生是多因素、多步骤、内外因交互并作用于正常大肠干细胞，经诱癌、促癌及演进多阶段而致癌的结果〔’:l.‘，，。大肠干细胞是指一群位于腺体凹陷部，具有增殖和分化潜能的未分化大肠上皮细胞，具有非对称性有丝分裂是其最显著的特征，所谓非对称性有丝分裂是指干细胞增殖分裂时形成l个性状与原干细胞完全相同的干细胞和1个分化细胞(暂时性放大细胞)，而不同于普通细胞增殖分裂时形成2个性状完全相同的子代细胞和肿瘤细胞增殖时的病理性有丝分裂。Musashi一1是干细胞进行非对称性有丝分裂的重要蛋白。近年发现表达Musashi一l和不表达碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)是大肠干细胞的重要标志〔’5·’司。微囊藻毒素是否具有致正常大肠干细胞DNA加成物形成和CagA蛋白是否具有促进正常大肠干细胞转化作用呢?目前尚无类同研究。 本研究拟通过建立永生化的正常大肠干(CryPt)细胞为靶点，探讨微囊藻毒素和从P.刀盯j菌CagA蛋白致正常大肠干(CryPt)细胞的转化作用，并观察分析转化过程中的分子事件的改变。提供候选的大肠癌变前期及早期分子标记，为从深层次发病机制上干预阻断、预防大肠癌发生提供理论依据。浙江大学博士研究生学位论文方法1.建立条件永生化正常大肠干(CryPt)细胞系。 用中性蛋白酶分级分离法从人胚大肠凹陷部分离碱性磷酸酶阴性的正常大肠CryPt细胞群，接种于Matrigel基质并用含端粒酶逆转录酶和Sv40大T抗原的重组逆转录病毒感染对其进行永生化，建立正常的大肠干(CryPt)细胞系，并进行生物学特性和致瘤性鉴定。2.微囊藻毒素致永生化正常大肠干细胞系DNA加成物形成。 建系的大肠干(CryPt)细胞为作用靶点。在培养的大肠干(Crypt)细胞中加入不同浓度(6.25一100ug/ml)的微囊藻毒素或不同浓度的微囊藻毒素加10mMol/L去铁敏再培养24h，消化细胞经离心洗涤2次，提取细胞基因组DNA和总RNA。基因组DNA分别经Rsal、Sl核酸酶酶切后，用ELISA法检测DNA产物中的8-轻一2’一脱氧鸟昔(8一ohdG)含量。总RNA经01190 dT15逆转录后用PCR扩增分析8一OhdG特异性的，切除修复基因h久浴I的表达改变。3.左刃1orz’ca酬可变区特征和干扰细胞信息能力测定。 对19例胃癌患者和20例慢性胃炎患者来源的从P-刀orjc刁酬可变区D、A片段经PCR扩增后测序分析其序列特征。构建包含2，3，4个EPIYA基序的c门gA/pcDNA3.l(+)真核表达质粒和‘a剧/pET15b原核表达质粒，再分别用定点突变技术将c刁gA/pCDNA3.1(+)质粒和ca酬/PET15b质粒印IYA重复序列中的酪氨酸突变为苯丙氨酸产生CagA突变体，最后分别转染AGS细胞和体外磷酸化方法测定分析CagA蛋白酪氨酸在体内外磷酸化状况。用Microarray芯片分析转染ea酬对细胞信息通路的干扰状况。4.微囊藻毒素和/或CagA蛋白致永生化正常大肠干(CryPt)细胞转化。 分成单用微囊藻毒素组、单用CagA蛋白组、微囊藻毒素加转染CagA蛋白