晚期氧化蛋白产物(Advanced oxidation protein products, AOPP)是体内氧化应激过程中生成的一类含双酪氨酸的蛋白质交联物,血浆AOPP以次氯酸(HOCl)氧化修饰的白蛋白为主。循环AOPP水平增高最先在慢性肾功能衰竭、腹膜透析的患者中被发现,随后在糖尿病、肥胖或代谢综合征、动脉粥样硬化等多种常见疾病中被证实。AOPP增高还见于类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎等免疫炎症性疾病和恶性肿瘤(结肠、直肠癌、乳腺癌等),因此AOPP被认为是体内氧化应激的敏感生物学标志。近年不断增加的研究证据表明,血浆AOPP水平增高促使该分子在肾脏和血管等组织中沉积并与慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)及动脉粥样硬化病变的发生发展密切相关。慢性AOPP在体内堆积促进糖尿病动物模型的肾脏的炎症反应和肾组织损伤,促使CKD动物模型的肾脏炎症和纤维化,并促使高脂血症动物发生动脉粥样硬化性病变。这些研究结果均表明,AOPP潴留不仅是反映体内氧化应激的指标,其本身可能是一类促进组织炎症和纤维化的生物致病分子。深入探讨AOPP在组织中的分布及其与病变的关系对于阐明AOPP致病的分子基础至关重要,并有可能为上述疾病的发生发展提供新的生物学标志或干预靶标。然而,目前检测组织中AOPP水平尚缺乏理想方法。检查外周血AOPP则通常采用比色分析法以340nm处吸光度值以反映标本中AOPP水平,这是基于AOPP结构含双酪氨酸,在酸性条件下于340nm处有一特异吸收峰。此法虽然简便,但易受血脂、纤维蛋白的干扰而影响其准确性；且不能用于对病变组织或细胞中的AOPP定位。我们拟建立免疫学检查方法克服上述缺点。采用体外次氯酸修饰的白蛋白作为抗原,成功制备了特异性识别AOPP的单克隆抗体,通过Western Blot、免疫组织化学染色首次证实单抗识别血清和沉积于肾脏中的AOPP,初步建立双单抗、单多抗及多单抗夹心ELISA法鉴定人工制备的AOPP,为深入研究AOPP这种内源性致病分子提供了必要工具。此外,我们利用噬菌体肽库筛选技术对AOPP模拟表位进行了初步探讨。第一章特异性识别天然AOPP单克隆抗体制备和鉴定以次氯酸(HOCl)氧化不同种属血白蛋白(包括人血清白蛋白HSA、小鼠血清白蛋白MSA、牛血清白蛋白BSA、兔血清白蛋白RSA)和人纤维蛋白原、人IgG、人低密度脂蛋白(LDL),按蛋白：HOCl摩尔比为1：140等体积混合,室温放置30分钟。制备的AOPP在PBS中透析24小时,除去游离的HOCl。AOPP含量通过测定酸性条件下340nm的吸光度,以氯胺T为标准测得。用AOPP-MSA为免疫原加佐剂免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(NS-1)融合,按常规方法制备杂交瘤。以AOPP-HSA为抗原包被酶标板,并以未氧化正常HAS做平行筛选以排除与正常蛋白的交叉反应。间接ELISA鉴定筛选特异性识别AOPP-HSA的杂交瘤克隆,所获两株命名为3F2和4C5；扩大培养后制备腹水,用辛酸硫酸铵沉淀法、HItrap Protein G亲和层析柱从腹水中纯化抗体。抗体类别鉴定显示3F2为IgG1,4C5为IgG2a。间接ELISA结果显示2株单抗均能与不同种属来源的氧化型白蛋白(AOPP-HSA、AOPP-BSA、AOPP-MSA、AOPP-RSA)、HOCl-人纤维蛋白原、HOCl-人IgG、HOCl-LDL特异性结合,而与未氧化蛋白及Cu2+氧化的LDL、糖基化蛋白均无交叉反应。竞争ELISA鉴定表明这两株单抗分别识别AOPP不同位点。Western Blot结果显示,在变性与非变性条件下,3F2可特异性结合人工制备的AOPP-HSA、HOCl-IgG、HOCl-人纤维蛋白原。单抗3F2亦可识别天然血浆与组织中的AOPP。能在一定程度上区分血液透析患者和正常人血浆中AOPP含量的差别以及慢性肾衰患者透析前后血浆AOPP含量的不同。免疫组织化学法检查显示3F2可特异性结合沉积于大鼠模型及各种慢性肾脏病患者肾组织中的AOPP,这种结合可被外源AOPP阻断。此外,3F2可阻断AOPP诱导小鼠单核细胞株RAW264.7细胞胞内氧化反应簇(ROS)生成。第二章建立双抗体夹心ELISA检测血浆AOPP的尝试以HItrap Protein G柱纯化抗体3F2和4C5,纯度达95%以上并按照操作流程标记生物素。分别以双单抗、多单抗夹心、单多抗夹心ELISA方法检测人工制备的AOPP并进行了体系的优化。在抗体包被浓度为1μg/ml,封闭液为0.25%酪蛋白,洗液与抗体稀释液均为0.5%PBST,检测抗体浓度为0.5μg/ml时即可良好检测标准品。之后,我们又试用了竞争ELISA的方法,以人工制备的AOPP-HSA 1.25μg/ml包被酶标板,倍比稀释AOPP-HSA (0-4μg/ml)、慢性肾衰患者、健康成人血清与0.5μg/ml Bio-3F2等体积混匀后加入板孔中,最后加入HRP-亲和素。标准曲线的拟合度良好,而且各种抗体组合的双夹心ELISA均可特应性地检出人工体外制备的AOPP,且敏感度可达ng/ml水平但是肾衰患者与正常人的测定值之间没有统计学意义。因此又尝试用敏感性更强的时间分辨荧光检测法检测患者血清AOPP,按照普通夹心ELISA的条件摸索,即以4C51μg/ml包被酶标板,酪蛋白封闭后,加入不同浓度的标准品AOPP-HSA,反应30min后加入Bio-3F2 0.5μg/ml,30min后加入铕标记的亲和素,15min后加入增强液,37℃反应5min后多功能酶标仪测值。所建立的标准曲线已经符合临床检测的需要,但是在血清样本的检测上面,还是存在一定的问题,最佳的包被与检测条件还要改变。第三章AOPP表位模拟序列的筛选鉴于已确定的自然和人工制备的AOPP均为在体内外次氯酸氧化的白蛋白、脂蛋白或其他蛋白,即已形成非天然抗原表位。本章工作的目的旨在探索体内是否有自然存在的类似于AOPP表位的序列,如果存在,将会对机体产生何种影响。我们以亲和层析纯化的抗AOPP多克隆抗体为靶标,对噬菌体随机十二肽库进行了三轮筛选后,鉴定出18个阳性克隆,均可与多抗产生较强的结合,且不为吸板克隆。挑选6个阳性克隆经DNA测序得到三条序列：GWLEENLFDHTR、SSALNDMLRDQR、DSLQDMLADEWQ。上述序列中具有近似的LXDMLXD (X为任意氨基酸)核心序列,提示这一核心序列有可能是模拟AOPP共同表位的优势序列。其次又以抗AOPP单克隆抗体3F2为靶标,筛选噬菌体十二肽库,经三轮筛选、ELISA鉴定获得18个与3F2特异结合的噬菌体克隆,但这些阳性克隆与抗AOPP多抗和4C5单抗无交叉反应。DNA测序得到SSYSQDAATLRL、LNTPYRNQLAYP、LPYFDSYDSALP AHPMPMTQLFTS四条序列中未发现保守序列。最后,在以单抗4C5为靶分子筛选噬菌体十二肽库,经ELISA鉴定得到的12个克隆与4C5特异结合,其中一个克隆(No.2)与多抗及单抗3F2较强结合。DNA测序得到的三种序列,LSPLPHPLTRTV、QNLPEWLALHLD、RASPDLLEHQLM,但未发现保守序列。采用NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的Blastp程序在蛋白质水平上对筛选的所有序列分别进行同源性搜索,其结果显示这些序列存在于某些真菌属、藻类的蛋白分子上,而并不存在于正常的人类与哺乳动物蛋白分子中。即模拟AOPP抗原表位的序列并不存在于已知的正常人与哺乳动物蛋白分子中,其意义在于避免了与AOPP表位相似而导致的后续事件,维持了机体内环境的稳定；也由此支持AOPP并非人体与动物的正常结构。