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第一部分RasGRP3在系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞及B细胞中的表达目的系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是以自身抗体的产生为特征的累及多个器官和组织的自身免疫病,内源性的高反应性B淋巴细胞是狼疮发病的重要环节。SLE患者中存在免疫分子的表达异常可导致BCR通路持续性激活,而RasGRP3(Ras guanyl nucleotide releasing protein3, Ras鸟苷酸释放蛋白3)主要在B细胞中表达,为BCR信号通路下游重要分子。本实验研究RasGRP3在SLE患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的表达,并进一步提取PBMC中的B细胞,研究RasGRP3在SLE患者外周血B细胞中的表达,并探讨其在SLE发病免疫机制的意义。方法收集临床上确诊SLE患者的外周血标本20例,以及正常志愿者20例,Ficoll法提取SLE患者及正常人外周血中的PBMC,采用免疫磁珠分选法纯化B细胞,流式检测B细胞的纯度。使用RT-PCR方法检测SLE患者及正常人PBMC和B细胞中RasGRP3的mRNA表达及用Western Blot方法检测蛋白的表达。其中10例标本用于PBMC中RasGRP3mRNA表达分析,5例标本用于RasGRP3蛋白表达分析,5例标本用于纯化B细胞,检测B细胞中RasGRP3mRNA的表达结果免疫磁珠分选法分选B细胞,其纯度能达到90%以上。SLE患者PBMC中RasGRP3的mRNA和蛋白质的表达水平明显高于正常人。在纯化后的B细胞中,与正常人相比,SLE患者RasGRP3的mRNA表达水平也明显升高。结论SLE患者外周血PBMC及B细胞中RasGRP3的mRNA和蛋白水平均较正常人高,提示B细胞中RasGRP3的异常表达可能参与狼疮发病。第二部分SLE患者PBMC中RasGRP3的mRNA水平与临床资料的关联目的研究RasGRP3的mRNA表达与SLE患者临床特征的联系,探讨其表达增高是否与SLE临床体征,实验室检查结果,病情活动程度有关。方法收集临床上确诊SLE患者26例用于分析PBMC中RasGRP3mRNA水平与临床特征的关联,Ficoll法提取PBMC, RT-PCR方法半定量检测其mRNA表达。通过回归统计分析SLE患者疾病活动程度与其PBMC中RasGRP3的mRNA表达的相关性。根据患者临床特征以及实验室检查结果分组,使用T检验研究RasGRP3的mRNA表达在每两组间有无差异。结果SLE患者PBMC中RasGRP3的mRNA表达水平与SLE疾病活动指数(SLEDAI)成正相关(p=0.0301),并且疾病活动期患者较静止期患者PBMC中RasGRP3的mRNA水平显著增加(p<0.05)。血尿、蛋白尿的SLE患者与非血尿、蛋白尿的患者相比,RasGRP3的mRNA表达显著增加(p<0.05)。结论RasGRP3可能为反应狼疮疾病活动的指标之一,并与肾脏损害有关,但本次研究样本量偏小,仍需大样本研究进一步验证。第三部分地塞米松对系统性红斑狼疮患者中RasGRP3表达的影响目的分别体内外研究糖皮质激素对SLE患者PBMC中RasGRP3的作用,探讨糖皮质激素通过抑制RasGRP3的表达治疗SLE的机制。方法选取临床上使用糖皮质激素(约lmg/kg强的松)的SLE患者10例,抽取其糖皮质激素治疗前及治疗后两周的外周血,提取PBMC。其中5例检测治疗前后PBMC中RasGRP3的mRNA表达水平,5例检测蛋白表达水平。在体外实验中,使用两种不同浓度地塞米松(1.10-5、1×10-6mol/L),与正常人PBMC细胞共同培养,在孵育时间为0h,12h,24h提取细胞,使用RT-PCR的方法检测RasGRP3的mRNA水平,选取合适的浓度。另外收集未经治疗的SLE患者6例,使用该浓度的地塞米松共孵育,观察不同时间点(0h、12h、24h)的地塞米松对PBMC中RasGRP3的mRNA水平的影响。并在地塞米松孵育0h,24h,48h提取细胞,使用western blot方法检测RasGRP3蛋白水平及下游信号通路p-ERK, p-AKT的水平。结果未使用糖皮质激素治疗时,SLE患者PBMC中RasGRP3的表达高于正常人,使用中等剂量糖皮质激素治疗2周后,RasGRP3的表达明显下降,接近正常人的表达水平。地塞米松能抑制正常人PBMC中RasGRP3的mRNA表达,1×10-6mol/L浓度的地塞米松对RasGRP3表达的有抑制作用且未明显引起细胞凋亡。使用该浓度的地塞米松与SLE患者PBMC共培养,观察不同时间点地塞米松对RasGRP3的抑制作用。我们发现,24h时地塞米松对PBMC内RasGRP3的mRNA及蛋白水平抑制作用最强。同时在24h地塞米松能明显抑制PBMC中pERK及p-AKT的表达。结论SLE患者在临床治疗时,使用糖皮质激素治疗2周后,PBMC中RasGRP3的水平下降。地塞米松能抑制正常人及SLE患者PBMC中RasGRP3及下游信号通路pERK及p-AKT的表达。这可能为激素的抗炎机制之一。