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在利用农林废弃物为代表的木质纤维素物料生产燃料乙醇的过程中,物料经预处理会产生大量抑制物,影响了后续工艺中微生物生长及发酵性能。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是一种具有工业生产应用潜力的乙醇发酵菌株,进一步提高其对抑制物的耐受性将有利于木质纤维素乙醇生产。由于胞内氧化还原电位(Oxido-Reduction Potential,ORP)改造能影响细胞的代谢流分配和胁迫耐受性能。因此本工作通过在Z.mobilis ZM4中过表达自身的10种与关键氧化还原电对NAD(P)H/NAD(P)~+相互转化相关的基因ZMO0899(NAD~+合成酶)、ZMO1113(NADH脱氢酶)、ZMO1116(谷氨酸合成酶,小亚基)、ZMO1117(谷氨酸合成酶,大亚基)、ZMO1211(谷胱甘肽还原酶)、ZMO1335(NAD(P)H脱氢酶)、ZMO1329(NAD~+激酶)、ZMO1753(NADP~+还原酶)、ZMO1885(NADH氧化酶)、ZMO1949(NAD(P)H脱氢酶),对胞内氧化还原电位进行扰动,考察重组菌株的耐受性改变。首先,本工作评估重组菌株的生长性能。结果表明,由于Z.mobilis的ED代谢途径产能效率低、代谢网络简单,即使过表达单个基因,也可能对其生长产生显著的负面影响,且影响程度与基因编码的蛋白功能密切相关。因此,在后续评估基因对于耐受性的影响时,需要考虑基因操作带来的生长负担的因素。其次,重组菌株对抑制物的耐受性检测结果表明,基因对菌株耐受性的提高具有抑制物的特异性:ZMO0899、ZMO1116、ZMO1753及ZMO1885过表达提高了菌株对糠醛的耐受性;ZMO1116过表达提高了菌株对香草醛的耐受性;ZMO1885过表达还提高了菌株对甲酸钠的耐受性;ZMO1753和ZMO1949过表达均可提高菌株对乙酸钠的耐受性。再次,为探索菌株对抑制物的耐受性机理,测定了重组菌株在不同胁迫条件下的胞内活性氧自由基ROS(Reactive Oxygen Species)、NAD(P)H/NAD(P)~+和ATP水平。结果表明,菌株的糠醛耐受性提高和ROS降低相关,而与胞内ATP水平无显著关联。胞内氧化还原酶通过直接降解糠醛或者间接为其他糠醛降解酶提供还原力NAD(P)H,或者清除糠醛引发的ROS来提高菌株对糠醛的耐受性。菌株的香草醛耐受性与ROS、NAD(P)H/NAD(P)~+和ATP水平都无明显关联,可能与谷氨酸合成酶(ZMO1116)的催化产物影响谷氨酸代谢有关。乙酸钠耐受性提高的菌株,胞内ATP水平提高且ROS降低,分别解决了由于乙酸进入胞内导致的能量损耗和ROS提升的问题。菌株对甲酸钠耐受性提高和胞内ATP水平有关,但是和乙酸钠耐受菌株不同的是,其胞内ROS水平并未发生变化,两者的差异可能是由甲酸钠具有醛基所造成。最后,木质纤维素水解液中存在糠醛、5-HMF、甲酸、乙酸等多种抑制物,它们会对微生物生长产生协同抑制作用。为考察耐受性菌株在多种抑制物共存的协同抑制条件下的发酵表现,挑选对单抑制物耐受性最强的重组菌株,在含有呋喃衍生物、羧酸类和酚类物质等多种类型抑制物的模拟木质纤维素水解液中评估其发酵性能。结果表明,发酵48 h时,相比对照菌株ZM4/20a,菌株ZM4/ZMO1885的生物量提高了41.3%,乙醇浓度提高了2.00倍,发酵液中残存糠醛为对照菌株的41.4%,5-HMF为对照菌株的60.8%,证明该菌株在纤维素乙醇工业生产中的潜在应用价值。综上,本工作通过胞内氧化还原扰动获得具有耐受表型的菌株,并发现菌株耐受机理和胞内NAD(P)H/NAD(P)~+、ROS、ATP密切相关,为开发耐受菌株提供新思路。