论文部分内容阅读
研究已经证实氧化特别是氧自由基与高等动物许多疾病的发生、发展密切相关。天然抗氧化剂在医药卫生、食品、化妆品以及饲料等领域有巨大的应用前景。β—葡萄糖苷酶(β—glucosidase，EC3，2.1.21)是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶。β—葡萄糖苷酶在食品、医药等领域应用广泛。本论文以抗氧化和胞外葡萄糖苷酶活性作为活性筛选指标，开展重要药用植物野葛(Pueraria phaseoloidesb)活性菌株筛选和相关研究。主要研究内容和结果如下：
1.野葛内生细菌抗氧化活性菌株筛选及研究。采用DPPH(1，1—二苯基苦基苯肼1，1—Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical2，2—Diphenyl—1—(2，4，6-Trinitrophenyl)hydrazyl)自由基清除法和ABTS(2，2’—连氮—双(3—乙基苯并噻唑—6—磺酸([2，2’—azino—bwas—3—ethylbenzothiazoline—6—sulfonic acid] diammonium salt)自由基清除法对37株野葛内生细菌进行初筛，23株菌株表现出DPPH和ABTS的清除能力。采用超氧自由基体系、羟基自由基体系以及油酸氧化体系等实验方法对野葛内生菌的抗氧化活性进行复筛，结果表明，11株菌株表现出较高的自由基清除活性和抑制脂质过氧化活性，野葛内生细菌菌株Ng2表现了良好的羟自由基、超氧阴离子自由基清除活性和抑制脂质过氧化活性。通过大孔树脂吸附、葡聚糖凝胶柱层析等活性成分分离技术对菌株Ng2的活性组分进行分离纯化。得到内生菌多糖D1和另一活性组分AD1，并对AD1进行了紫外光谱、高效液相色谱及气质联用(GC—MS)进行检测。GC—MS检测结果表明菌株Ng2抗氧化活性组分之一 AD1为生物碱类物质，其主要成分为3—甲基—哌嗪—2,5—二酮、六氢化—吡咯环[1，2—a]吡嗪—1，4—二酮和1，4—二苯基哌嗪。最后对抗氧化活性组分AD1和D1进行了体外、体内抗氧化活性的定量研究。AD1和D1均表现较强的自由基清除活性；同时，AD1和D1也能抑制脂质过氧化活性和小鼠肝匀浆中丙二醛MDA生成。体内小鼠实验表明，与D—半乳糖诱导的衰老对照组相比，AD1样品组(100 mg/kg)能显著提高小鼠血清中超氧化物歧化酶SOD活性(提高9.088％)和谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px活性(提高41.668％)，抑制小鼠组织中MDA的生成(降低40.830％)，能够增加衰老模型小鼠的心指数、脾指数、肾指数和脑指数。
2.野葛内生细菌β—葡萄糖苷酶产生菌株筛选及研究。利用DNS法筛选到4株产β—葡萄糖苷酶的菌株(Pa2s、Pa2h、NJ1、Ng2)并通过单因子方法探讨环境因素(碳源、氮源、装液量、初始pH值和温度)对上述菌株产β—葡萄糖苷酶的影响。在实验的条件下，菌株Pa2s产酶的最适碳源为葡萄糖，最适氮源为磷酸二氢钾，最适初始pH值为8，装液量150ml/250ml，最佳发酵温度23℃；菌株Pa2h最适碳源为葡萄糖，最适氮源为磷酸二氢钾，最适初始pH值为8，装液量100ml/250ml，最佳发酵温度29℃；菌株Ng2最适碳源为可溶性淀粉，最适氮源为玉米面，最适初始pH值为7.5，装液量200ml/250ml，最佳发酵温度23℃；菌株NJ1最适碳源为蔗糖，最适氮源为磷酸二氢钾，最适初始pH值为8，装液量100ml/250ml，最佳发酵温度29℃。最后通过酶学性质研究，四株野葛内生菌株所产的β—葡萄糖苷酶均适于酸性环境，最适pH约为4—5；其最适温度在40℃—50℃之间。
3.活性菌株的初步鉴定。对12株具有较强抗氧化活性和β—葡萄糖苷酶的活性内生菌株进行了16s rDNA PCR扩增和序列分析的分子生物学初步鉴定。通过BLAST软件在NCBI网站中进行同源性比较，采用Bioedit7.0和Treedrawing软件绘制系统发育树。菌株Ng2与短小芽孢杆菌菌株3—2(Bacillus pumilus strain3—2)有最高相似性(同源性100％，登录号：EU594558.1)。菌株Pa2s与枯草芽孢杆菌菌株A2(Bacillus subtilis strain A2)有最高相似性(同源性99％，登录号：EU567068.1)。