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肠上皮紧密连接(tight junctions, TJ)是肠黏膜屏障功能最重要的解剖学基础。TJ形成一道高度选择性屏障,以防止肠腔内有害物质如毒素或细菌穿过肠黏膜进入血液循环或其他组织器官。TJ的破坏及其所导致的肠黏膜屏障功能受损在一系列肠道受损疾病发病机制中起着关键作用,如炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)、梗阻性黄疸(obstructive jaundice, OJ)、急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)、酒精性肝病(alcohol-induced liver injury)、坏死性小肠炎和感染性小肠炎等。目前,上皮屏障功能受损的确切机制尚未完全阐明,但很多研究表明氧化应激损伤是破坏TJ影响肠黏膜屏障功能的重要因素。细胞正常的有氧代谢持续产生一定量的过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2),并迅速被抗氧化物酶如溶酶体中的过氧化氢酶、线粒体中的谷胱甘肽过氧化物酶清除。异常情况下H2O2不能被及时清除会导致细胞损伤。低微摩尔水平的H2O2与生物系统的相互作用微弱,但是高浓度的H2O2能使糖酵解过程中的3-磷酸甘油醛脱氢酶失活。众多研究表明H2O2能够导致肠上皮屏障功能损伤。在Caco-2细胞单层,H2O2介导的氧化应激损伤破坏上皮屏障功能已经被证实。血红素加氧酶-1(heme oxygenase, HO-1)是血红素分解代谢的限速酶,它通过降解血红素产生等摩尔的胆绿素(biliverdin)、一氧化碳(carbon monoxide, CO)和游离铁(iron)。HO-1为诱导型酶,通常被H2O2、亚铁血红素、重金属离子、细胞毒素、内毒素等具有细胞损伤作用的致氧化应激因素所诱导。目前多项体内、外研究证实诱导HO-1表达是机体氧化应激状态下重要的细胞保护机制。姜黄素(curcumin, Cur)是从姜科植物姜黄、莪术中提取的有效成份,具有抗氧化、抗感染、抗肿瘤、抗病毒等广泛的药理作用。Cur已被证实是一种天然的HO-1强诱导剂。目的:姜黄素对H2O2介导的肠单层上皮氧化应激损伤的保护作用。方法:Caco-2细胞形成体外肠上皮细胞屏障模型后,用H2O2诱导氧化应激损伤。实验分为DMSO组,H2O2(500μM)组[26],H2O2+不同浓度Cur组(5, 20, 80μM),H2O2+Cur(20μM)+Znpp(20μM)组(Znpp是HO-1的特异性抑制剂),共同孵育,分别在1h、3h、6h收集标本。收集细胞培养液检测LDH、MDA、SOD;测量单层上皮的跨上皮细胞电阻(trans-epithelial electrical resistance, TEER)和荧光素钠透过率;Western blot和免疫荧光化学方法检测occludin和ZO-1在细胞单层的表达及定位;用Western blot和real-time PCR方法检测HO-1蛋白及mRNA表达水平。结果:1体外肠上皮细胞屏障模型制作成功。2姜黄素对H2O2介导的细胞毒性和氧化应激损伤的保护作用。①姜黄素对H2O2介导的细胞毒性的保护作用:H2O2组较DMSO组LDH活性明显升高(P<0.001),H2O2+不同浓度Cur组均较H2O2组降低(P<0.05),但H2O2+不同浓度Cur组间无统计学差异(P>0.05)。②姜黄素对H2O2介导的氧化应激损伤的保护作用:H2O2组较DMSO组脂质过氧化产物MDA水平明显升高(P<0.001),抗氧化物SOD活性明显降低(P<0.05)。H2O2+不同浓度Cur组MDA均较H2O2组降低(P<0.001),而SOD活性增加(P<0.05),H2O2+不同浓度Cur组间MDA水平及SOD活性变化均不明显(P>0.05)。3姜黄素对H2O2介导的肠单层上皮通透性增高的保护作用。①姜黄素对H2O2介导的肠单层上皮TEER降低的影响: TEER%=TEER/干预前TEER×100%,用TEER%来表示TEER变化。H2O2组TEER%较DMSO组明显降低(22.71±3.11% vs 99.60±1.30%, P<0.001)。H2O2+不同浓度Cur组均较H2O2组明显增高(49.05±13.99%, 52.02±10.15%, 43.24±12.26% vs 22.71±3.11%, P<0.05),且H2O2+20μM Cur组最佳(P<0.05)。②姜黄素对H2O2介导的肠单层上皮荧光素钠透过率增加的影响:H2O2组荧光素钠透过率较DMSO组明显升高(32.00±4.97% vs 6.10±1.43%, P<0.001),H2O2+不同浓度Cur组均较H2O2组明显降低(20.25±2.63%, 12.41±2.19%, 19.25±2.81% vs 32.00±4.97%, P<0.05),且H2O2+20μM Cur组降低明显(P<0.05)。H2O2+Cur(20μM)+Znpp(20μM)组较H2O2+20μM Cur组的荧光素钠透过率明显增加(31.01±2.28% vs 12.41±2.19%, P<0.001),与H2O2组无统计学差异(P>0.05)。4姜黄素对H2O2介导的TJ蛋白occludin和ZO-1破坏的保护作用。①Western blot结果显示:TJ蛋白occludin表达水平H2O2组较DMSO组明显降低(53.67±24.19% vs 178.00±29.51%, P<0.001),H2O2+不同浓度Cur组均较H2O2组明显升高(115.00±18.03%, 175.67±29.50%, 120.67±32.72% vs 53.67±24.19%, P<0.05),治疗组间也存在差别,H2O2+20μM Cur组表达量最高(P<0.05)。H2O2+Cur(20μM)+Znpp(20μM)组(80.33±13.05%)较H2O2+20μM Cur组的occludin表达水平明显降低(P<0.001),且与H2O2组无统计学差异(P>0.05)。ZO-1蛋白表达结果与occludin变化一致。H2O2组较DMSO组明显降低(36.00±15.88% vs 133.00±26.46%, P<0.001),H2O2+不同浓度Cur组均较H2O2组明显升高(90.33±22.50%, 139.67±33.71%, 92.00±24.33% vs 36.00±15.88%, P<0.05), H2O2+20μM Cur组表达量最高(P<0.05)。H2O2+Cur(20μM)+Znpp(20μM)组(50.00±15.13%)较H2O2+20μM Cur组明显降低(P<0.001),与H2O2组无统计学差异(P>0.05)。H2O2+20μM Cur干预细胞在1h,3h,6h检测occludin蛋白表达水平较H2O2组明显升高(185.00±51.64%, 300.67±27.10%, 424.33±69.66% vs 84.00±19.00%, P<0.05),并且呈时间依赖6h最高(P<0.05)。ZO-1蛋白表达与occludin蛋白表达变化趋势一致。ZO-1蛋白表达在1h,3h,6h较H2O2组明显升高(48.67±20.01%, 82.00±12.12%, 114.67±20.50% vs 15.00±12.53%, P<0.05),6h时ZO-1蛋白表达水平较其他时间组高(P<0.05)。②免疫荧光结果显示:DMSO组occludin蛋白表达连续完整,荧光强度高;H2O2组occludin蛋白表达断续不完整,荧光强度弱;H2O2+20μM Cur组较H2O2组明显好转,H2O2+Cur(20μM)+Znpp(20μM)组与H2O2组表现相似。ZO-1变化与Occlludin结果变化一致。5姜黄素对HO-1蛋白及其mRNA的诱导作用。①Western blot结果显示:HO-1蛋白表达水平H2O2组较DMSO组升高(99.00±10.00% vs 4.67±2.00%, P<0.001),H2O2+不同浓度Cur组均较H2O2组明显升高(198.67±87.96%, 291.00±9.17%, 191.33±37.11% vs 99.00±10.00%, P<0.05),H2O2+20μM Cur组HO-1蛋白表达量最高(P<0.05)。H2O2+Cur(20μM)+Znpp(20μM)组HO-1蛋白表达水平(96.00±13.05%)低于H2O2+20μM Cur组(P<0.001),且与H2O2组无统计学差异(P>0.05)。H2O2+20μM Cur干预1h,3h,6h HO-1蛋白表达水平较H2O2组明显升高(149.33±6.81%, 263.67±16.50%, 372.33±102.34% vs 43.67±10.60%, P<0.05),且各治疗组间均有统计学差异,6h时表达水平最高(P<0.05)。②HO-1 mRNA表达水平H2O2组较DMSO组升高(P<0.05),H2O2+不同浓度Cur组均较H2O2组明显升高(5.98±0.91, 7.58±1.55, 6.66±1.48 vs 3.84±0.90, P<0.05),但是治疗组间差别不大(P>0.05)。H2O2+Cur(20μM)+Znpp(20μM)组(4.41±1.21)较H2O2+20μM Cur组降低(P<0.05),与H2O2组无统计学差异(P>0.05)。H2O2+20μM Cur干预1h,3h,6h HO-1 mRNA较H2O2组明显升高(3.92±0.79, 4.34±1.03, 4.95±1.14 vs 1.00±0.00, P<0.05),且治疗组间HO-1 mRNA表达水平存在统计学差异,6h时最高(P<0.05)。结论:应用500μM H2O2能够导致细胞毒性和氧化应激损伤,低浓度的Cur就能起到抗细胞毒性和抗氧化作用。H2O2能够介导TJ破坏和肠上皮屏障功能受损,Cur通过HO-1途径改善H2O2介导的TJ和肠黏膜屏障功能受损。