氢化可的松是重要的糖皮质激素药物,从廉价易得原料17-羟孕酮通过生物转化合成氢化可的松具有重要的研究和应用价值。17-羟孕酮到氢化可的松的转化路径需要两个关键P450——CYP21A2与CYP11B1的参与。本研究在大肠杆菌MG1655(DE3)中构建17-羟孕酮到氢化可的松的生物转化路径,并通过关键P450的工程化改造来增强其催化效率,提高催化特异性。一方面,以CYP21A2催化17-羟孕酮到11-脱氧皮质醇的反应为研究对象,选取4种不同来源的CYP21A2分别在大肠杆菌MG1655(DE3)中表达。仅人源(Hs＿CYP21A2)和斑马鱼源(Dr＿CYP21A2)的CYP21A2能够实现目标反应,且表达Hs＿CYP21A2时11-脱氧皮质醇的产量是表达Dr＿CYP21A2的1.76倍。在此基础上,对Hs＿CYP21A2进行二级结构预测,对N端2-11位构成疏水结构的氨基酸残基(LLLGLLLLP)进行截短,以增强Hs＿CYP21A2的可溶性表达水平。然而结果显示截短后的蛋白表达量下降,且丧失了催化17-羟孕酮的能力。另一方面,以m CYP11B1(Hs＿CYP11B1,G25R/G46R/L52M)催化17-羟孕酮到21-脱氧皮质醇的反应为研究对象,通过对CYP11B1和底物复合体结构进行分析,获得可能影响C11位催化特异性的6个氨基酸残基,并在m CYP11B1中进行定点突变。其中,突变体E310T对C11位催化特异性最高,产物/副产物的比例较突变前提高5.8倍,产量提高1.7倍;而突变体S315E获得最高的21-脱氧皮质醇转化速率(提高2.4倍),产物/副产物的比例提高2.8倍。与此同时,通过系统进化树的构建和分析,选择亲缘关系较远的4种氧还蛋白以及3种氧还蛋白还原酶与m CYP11B1进行适配性研究。与使用常用电子传递体系皮质铁氧还蛋白(Adx)-氧还蛋白还原酶(Ad R)相比,来源于变形杆菌的氧还蛋白Pdx GAB和来源于嗜热菌的氧还蛋白还原酶Pd RACM的电子传递体组合使21-脱氧皮质醇的转化速率提高3.3倍。最终,通过共表达来源于裂殖酵母的与皮质铁氧还蛋白同源的氧还蛋白还原酶Arh-氧还蛋白Etp-Hs＿CYP21A2和Pdx GAB-Hs＿m CYP11B1(E310T)-Pd RA CM在大肠杆菌中实现了17-羟孕酮到氢化可的松的生物转化,为氢化可的松的生产提供了一种新策略。