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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)是严重威胁世界各国养猪业的重要病原之一。PRRSV感染可引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病。PRRSV分为欧洲型和美洲型两个血清型，病毒基因组ORF1编码14种非结构蛋白，ORF2-7编码7种结构蛋白。猪肺泡巨噬细胞（PAM）是PRRSV嗜好的宿主细胞。本研究构建猪肺泡巨噬细胞cDNA文库，利用酵母双杂交技术筛选与PRRSV核衣壳蛋白(N)相互作用的肺泡巨噬细胞蛋白，成功筛选到PABP、PIAS-1和iPABP3个候选蛋白。利用GSTpull-down、免疫共沉淀以及激光共聚焦技术证实PRRSVN与PABP相互作用。通过蛋白截短突变和GST/Hispull-down技术，鉴定了PABP与N蛋白相互作用的位点。筛选到表达靶向PABP基因shRNA的重组质粒pSUPER-shPABP1＃，检测干扰细胞PABP对病毒增殖的影响，结果表明干扰细胞PABP能有效抑制PRRSV增殖。PRRSV基因组5UTR中存在一些顺式调控元件，可能与蛋白结合调控病毒复制、转录和翻译。利用体外转录RNA技术、RNApull-down和质谱分析技术筛选PAM细胞中与PRRSV5UTR相互作用的蛋白质，成功筛选到hnRNPR、OLIG2和SRPR-β3个候选蛋白。主要研究内容分为以下5个部分: 1.猪肺泡巨噬细胞cDNA文库的构建 猪肺泡巨噬细胞(PAM)是PRRSV嗜好的宿主细胞。本研究从PRRSV阴性猪肺脏分离获得肺泡巨噬细胞，提取总RNA，以SMART技术合成第一链cDNA，通过LD-PCR技术扩增成双链DNA，并将纯化后的双链DNA和线性化的酵母表达载体pGADT7-rec载体一起转化入酵母Y187菌株，利用酵母细胞内的同源重组酶活性，完成二者的连接重组。最终收集转化外源基因的酵母菌，文库质量鉴定结果为插入外源片段大小在300-2000bp之间，初始文库库容量在2.15×106cfu，符合酵母双杂交筛选要求，为了深入研究PRRSV与宿主细胞相互作用机制奠定了重要基础。 2.PRRSVN蛋白诱饵质粒构建及其感染细胞互作蛋白的初步筛选 为了利用酵母双杂交技术筛选PAM细胞中与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白相互作用的蛋白质，本研究采用RT-PCR技术，扩增获得PRRSVN蛋白基因并定向克隆至酵母双杂交系统的表达质粒pGBKT7中，通过酶切鉴定和测序后转化入酵母菌株Y2HGold进行表达，融合蛋白经自激活、毒性及Western-blot检测，结果显示，成功构建N蛋白诱饵质粒酵母菌。用该诱饵酵母菌Y2H[pGBKT7-N]与文库酵母菌Y187[PAMcDNA文库]进行互作筛选，筛选出5个阳性菌落。通过酵母回归试验对假阳性进行排除，以及对阳性菌文库质粒的基因序列分析，最后确定酵母双杂交筛选与PRRSVN蛋白相互作用的蛋白有3种，即PABP(poly(A)-bindingprotein1，GeneBankID:XM_001927747.1),PIAS-1(proteininhibitorofactivatedSTAT1,GeneBankID:NM_001075396.1,iPABP(induciblepoly(A)-bindingprotein,GeneBankID:NM001083724.1)。 3.PRRSVN蛋白与Poly(A)结合蛋白（PABP）之间相互作用的鉴定 为了验证PRRSVN蛋白与PABP之间的相互作用，利用GSTpull-down和免疫共沉淀技术，分别证明了在体外和细胞内二者都可以结合。用RNase处理的细胞蛋白进行免疫共沉淀试验进一步证实了PABP与N蛋白之间的相互作用并不是由RNA介导的，而是不依赖RNA的直接相互作用。利用激光共聚焦技术证实PABP和N蛋白在PRRSV感染的Marc-145和PAM细胞内都具有共同定位，且PABP在感染病毒的细胞核中呈现明显小点状聚集，说明PABP在病毒感染后其细胞定位发生变化，预示PABP-N相互作用可能与病毒复制有关。为了进一步鉴定PABP与N蛋白相互作用的区域，将PABP分为N段(1-368aa)和C段（369-636aa），并分别克隆到pGEX-6p-1载体进行原核表达。通过GSTpull-down试验证实，PABP的C段蛋白(369-636aa)可以与N蛋白结合。为了鉴定N蛋白与PABP相互作用的位点，我们根据N蛋白的结构特点将其分别做了9个截短突变体，并分别克隆到pET32a载体上，表达了一系列N蛋白的截短体蛋白。利用Hispull-down技术，证实9种截短突变体中只有C86、C98和N69不能与PABP结合，它们共同的特征是缺失了N蛋白第52-57位氨基酸，因此52-57位氨基酸是N蛋白与PABP相互作用的位点。 4.靶向细胞PABP基因小干扰RNA抑制PRRSV增殖 为了进一步理解PABP-N相互作用对PRRSV复制的影响，本研究通过RNA干扰技术干扰细胞PABP的表达，观察干扰PABP对病毒增殖的影响。首先针对PABP基因设计了3个siRNA，分别构建3个靶向PABPshRNA的重组质粒，通过Western-blot分析对重组质粒的干扰效果进行了筛选。结果显示，pSUPER-shPAPB1＃质粒可以有效的抑制Marc-145细胞中PABP的表达。将pSUPER-shPABP1＃转染Marc-145细胞，24h后再感染相同剂量的PRRSV，感染病毒后不同的时间，分别用Real-timePCR、Western-blot和TCID50方法检测干扰PABP表达对病毒增殖的影响效果。结果显示，病毒随着细胞PABP表达量的降低，病毒RNA的合成受到抑制、N蛋白的表达量下降，并且PRRSV病毒滴度明显降低。说明靶向干扰细胞PABP能够在一定程度上抑制PRRSV病毒增殖。 5.PAM细胞中与PRRSV基因组5UTR相互作用蛋白的筛选 PRRSV的基因组具有5和3啡编码区(UTR)。近年来病毒UTR的功能研究成为生物学研究的热点之一。病毒UTR往往存在一些调控元件，如内部核糖体进入位点（internoribozymeentrysite，IRES）和茎环结构等。一些蛋白质或蛋白复合物可能与这些调控元件结合，从而调控病毒的复制、转录和翻译等。本研究利用RNApull-down和MALDI-TOF-TS质谱分析技术，从猪肺泡巨噬细胞裂解液中分离和鉴定与PRRSV5UTR相互作用的蛋白质。首先利用体外转录RNA技术，成功的转录了生物素标记的PRRSV基因组的5端非翻译区RNA（Biotinlabeled5UTR）。然后利用RNApull-down技术使Biotinlabeled5UTR与猪肺泡巨噬细胞(PAM)蛋白相互作用，筛选出3个与Biotinlabeled5UTR结合的候选细胞蛋白。通过对3个候选蛋白的质谱分析，鉴定出它们分别是核内不均一核糖体蛋白R(HeterogeneousnuclearribonucleoproteinR，hnRNPR)、少突细胞转录因子2样蛋白(Oligodedrocytetranscriptionfactor2-like，OLIG2)和信号识别颗粒受体β亚基Signalrecognitionparticlereceptorsubunitbeta-like，SRPR-β）。针对3个候选蛋白与PRRSV5UTR的相互作用的鉴定工作有待进一步研究。