第一部分乳腺癌细胞膜仿生纳米分子探针的制备、表征及基本性能检测目的制备一种乳腺癌细胞膜包覆的载血卟啉单甲醚/超顺磁性氧化铁的仿生纳米分子探针（CHINPs）,检测其表征、光热性能及活性氧产生性能。方法1.纳米粒的制备及表征:通过化学裂解及反复冻融法提取乳腺癌4T1细胞膜,然后以双乳化法联合挤压法制备癌细胞膜（Cancer cell membrane,CCM）包被的载血卟啉单甲醚（Hematoporphyrin monomethyl ether,HMME）及超顺磁性氧化铁（Superparamagnetic iron oxide,SPIO）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polylactic acid-glycolic acid copolymer,PLGA）仿生纳米粒作为分子探针（CHINPs）。光学显微镜及激光共聚焦显微镜（Laser confocal microscope,CLSM）下观察其形态,以透射电镜（transmission electron microscope,TEM）分析其结构;通过马尔文粒径仪检测其粒径、电位;采用紫外分光光度法及电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma massspectrometry,ICP-MS）分别检测纳米粒中HMME及SPIO含量,并计算包封率和载药量;采用蛋白质凝胶电泳（protein gel electrophoresis,SDS-PAGE）检测纳米粒携带蛋白的情况,验证其细胞膜包被效果。2.纳米粒的基本性能:检测不同浓度的CHINPs在808 nm激光仪激发下的光热性能及光热稳定性;以单线态氧探针（singlet oxygen sensor green,SOSG）验证纳米粒产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）的性能;以2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2,7-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）检测纳米粒在细胞水平ROS的产生性能。结果1.纳米粒的表征:采用挤压法及双乳化法所制备的纳米粒CHINPs呈浅棕色,光镜及激光共聚焦显微镜下可见纳米粒分散性良好,大小均一,形态规则,透射电镜下可见纳米粒呈球形“核壳结构”。马尔文粒径仪测得CCM、HINPs及CHINPs的粒径分别为337.8±6.4 nm,198.9±1.4 nm和228.1±6.2 nm,Zeta电位分别为-20.5±0.4 m V,-10.7±1.3 m V和-19.3±0.6 m V;血卟啉单甲醚的包封率为82.12%,载药量为3.16%。超顺磁性氧化铁包封率为89.21%,载药量为1.83%。SDS-PAGE结果显示CHINPs与CCM、4T1细胞裂解液具有几乎相同的蛋白谱。2.纳米粒的基本性能:CHINPs在808nm激光激发下具有良好的光热转换性能及稳定性;经SOSG探针检测,CHINPs在超声辐照下可产生ROS;DCFH-DA探针检测到CHINPs与细胞孵育后经超声辐照可产生大量的ROS。结论本研究成功制备出乳腺癌细胞膜仿生纳米分子探针（CHINPs）,该分子探针具有良好的光热及产生活性氧的性能。第二部分乳腺癌细胞膜仿生纳米分子探针同源靶向性评估及光声/磁共振双模态成像研究目的体外观察CHINPs靶向同源乳腺癌4T1细胞的能力,探讨其体外PAI及MRI效果;建立Babl/c小鼠原位乳腺癌模型,观察CHINPs体内靶向同源肿瘤及体内PAI及MRI效果,进而评估其作为双模态造影剂的体内成像能力。方法1.CHINPs体外同源靶向及光声、磁共振成像:将非靶向HINPs及靶向CHINPs分别和乳腺癌4T1细胞共孵育1h、2h、3h、4h后,在激光共聚焦显微镜及流式细胞学检查下观察4T1细胞吞噬纳米粒的情况。同时,将非靶向HINPs及靶向CHINPs分别与其他肿瘤细胞（MDA-MB-231细胞,MG63细胞,B16F10细胞）及巨噬细胞RAW264.7孵育4h后,在激光共聚焦显微镜及流式细胞学检查下观察CHINPs被不同肿瘤细胞的吞噬及逃逸巨噬细胞吞噬的情况。将不同浓度的CHINPs分别置入凝胶孔模型及2ml EP管中,观察其在激发波长为725nm时增强光声成像的效果及在磁共振成像系统下的成像效果,并对信号强度进行定量分析。2.CHINPs体内同源靶向及光声、磁共振成像:建立Babl/c小鼠原位乳腺癌模型,通过尾静脉分别注射Di R标记的HINPs或CHINPs,于不同时间点（注射前,注射后1h,3h,6h,24h及48 h）进行小鼠活体荧光成像,然后以成像系统软件测量小鼠肿瘤区域荧光信号值,评估CHINPs靶向肿瘤的性能。同时于注射纳米粒24 h后,处死小鼠,取肿瘤和重要脏器（心、肝、脾、肺、肾）进行离体组织荧光成像,并进一步通过ICP-MS定量分析CHINPs的组织分布情况。通过荷瘤小鼠尾静脉分别注射HINPs或CHINPs,于不同时间点（注射前,注射后1h,3h,6h,24h及48 h）分别进行光声成像、T2加权磁共振成像,并利用系统相关软件进行感兴趣区域（Region of interest,ROI）信号强度的定量分析,观察CHINPs的体内成像效果。结果1.CHINPs体外同源靶向及光声、磁共振成像:靶向纳米粒CHINPs组,乳腺癌4T1细胞周围有大量纳米粒聚集,荧光强度高,而其他肿瘤细胞（MDA-MB-231细胞,MG63细胞,B16F10细胞）周围纳米粒较少,荧光强度低;非靶向纳米粒HINPs组,所有肿瘤细胞周围均只有少数纳米颗粒聚集,表明CHINPs能靶向同源4T1细胞;巨噬细胞RAW264.7周围有大量的非靶向纳米粒HINPs,少许靶向纳米粒CHINPs,表明CHINPs经细胞膜修饰后可逃逸巨噬细胞吞噬。体外PAI及MRI结果显示:纳米粒CHINPs可增强光声成像,其光声信号呈浓度依赖性,随其浓度的升高而增强;T2加权MRI成像呈负增强,信号强度随其浓度的升高而减低,弛豫率随浓度升高逐渐升高。2.CHINPs体内同源靶向及光声、磁共振成像:荷瘤小鼠活体荧光成像发现,靶向纳米粒CHINPs组可分布于肿瘤区域,该组肿瘤部位荧光信号显著高于非靶向纳米粒HINPs组,且其荧光信号值在注射后逐渐升高,于24 h达到高峰后逐渐下降。离体荧光成像及ICP-MS进一步证实,CHINPs可靶向聚集于肿瘤区域。荷瘤小鼠经尾静脉注射纳米粒CHINPs后,肿瘤区域的光声信号逐渐增强,在24小时达到最高峰后缓慢下降,而T2加权磁共振信号则与其相反,先下降达最低值后再逐渐升高,呈负增强。结论制备的细胞膜纳米分子探针CHINPs能主动靶向同源乳腺癌细胞,具有良好的体外光声及T2加权磁共振成像的性能。荷瘤小鼠的实验表明CHINPs能有效地在肿瘤部位聚集,可作为理想的造影剂进行PAI/MRI双模态成像。第三部分乳腺癌细胞膜仿生纳米分子探针用于光热/声动力协同PD-1抗体抗肿瘤治疗的实验研究目的观察CHINPs用于光热/声动力协同PD-1治疗乳腺癌的效果,并进行体内免疫机制的分析,评估CHINPs体内外的生物安全性。方法1.CHINPs体外细胞毒性及光热/声动力联合抗肿瘤:通过CCK-8法评估CHINPs纳米分子探针对乳腺癌4T1细胞的细胞毒性作用。在808 nm激光及低强度聚焦超声的辐照下,通过流式细胞术及激光共聚焦显微镜评估光热和声动力联合治疗对乳腺癌4T1细胞的杀伤作用。2.CHINPs体内光热/声动力联合协同PD-1抗肿瘤治疗:建立Balb/c小鼠双侧原位肿瘤模型（右侧:原位瘤,左侧:人工远处转移瘤）,当原位瘤体积约50-60 mm3时,将荷瘤小鼠随机分为9组（n=6）,包括:对照组;激光+超声组;单独CHINPs组;抗PD-1组;CHINPs+激光组（PTT组）;CHINPs+超声组（SDT组）;HINPs+激光+超声组（非靶向PTT/SDT组）;CHINPs+激光+超声组（靶向PTT/SDT组）;CHINPs+激光+超声+抗PD-1组（靶向PTT/SDT/抗PD-1组）。按分组分别经尾静脉注射200μl PBS、HINPs或CHINPs 24h后,给予激光或/和超声辐照肿瘤,观察各组荷瘤小鼠左、右两侧肿瘤的生长情况及小鼠体重,每隔一天用游标卡尺测量荷瘤小鼠双侧肿瘤的最大径及最小径,计算其体积,并给小鼠称重,为期16天。同时每组荷瘤小鼠在处理后3天,随机处死一只并收集右侧原发瘤进行H&E,TUNEL和Ki67染色,评估肿瘤细胞增殖和凋亡的情况,并进行定量分析。3.免疫机制评估:为了评估CHINPs用于光热/声动力联合协同PD-1免疫治疗的机制,每组荷瘤小鼠在治疗后的第7天,收集人工远处瘤制备成单细胞悬浮液,进行免疫荧光抗体染色,利用流式细胞学分析T细胞的分型,同时采集小鼠血样,采用ELISA法检测血清细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-12的分泌情况。4.CHINPs生物安全性评估:采用健康昆明小鼠评估CHINPs的急性及慢性毒性作用,以评估其体内生物安全性,将200μl CHINPs经尾静脉注射入健康昆明小鼠,于注射后1天,7天,14天,28天处死小鼠,收集血液标本做血常规及血生化检查,取出各主要器官（心、肝、脾、肺、肾、肠）进行H&E染色,观察其组织形态学变化。结果1.CHINPs体外细胞毒性及光热/声动力联合抗肿瘤:单独CHINPs与4T1细胞共同孵育,不应用超声辐照时,对细胞存活率无明显影响,在808 nm激光仪及低强度聚焦超声的辐照下可分别通过光热效应、声动力产生活性氧的效应杀灭乳腺癌4T1细胞,相较于单独的光热治疗组及单独的声动力治疗组,光热治疗联合声动力治疗可显著增强杀伤乳腺癌4T1细胞效果,且经过细胞膜包裹后,其联合治疗效果进一步加强。2.CHINPs体内光热/声动力联合协同PD-1抗肿瘤治疗:荷瘤小鼠体内治疗研究中,单独的激光+超声组及单独CHINPs组无论原发瘤还是远处瘤,肿瘤体积、抑瘤率及肿瘤重量较对照组均无统计学差异,表明单独的激光+超声组及单独CHINPs组不能抑制肿瘤的生长。而光热治疗组和声动力治疗组,原发瘤与转移瘤的生长均受到轻微的抑制,表明光热治疗及声动力治疗均能在一定程度上抑制肿瘤生长。而靶向纳米粒CHINPs介导的光热治疗联合声动力治疗组,原发瘤的生长在前1周内完全受到抑制,治疗效果强于未经细胞膜包裹的HINPs介导的光热治疗联合声动力治疗组,但1周后原发瘤出现了复发,而且其转移瘤也未受到明显抑制。而只有在靶向纳米粒CHINPs介导的光热联合声动力协同PD-1组,无论是原发瘤还是远处瘤的生长均完全被抑制,表明CHINPs介导的光热联合声动力治疗可协同PD-1抗体抗肿瘤治疗,不仅可有效消除原发瘤,而且可抑制转移瘤生长。肿瘤组织H&E染色结果显示,光热联合声动力协同PD-1治疗组肿瘤细胞形态被破坏,可见核固缩、碎裂及溶解;TUNEL和Ki67染色结果显示光热联合声动力协同PD-1治疗组相对于其他组细胞增殖指数低、凋亡指数高,具有统计学差异（P<0.05）。3.免疫机制分析:各组荷瘤小鼠的左侧肿瘤（人工远处转移瘤）经免疫荧光抗体染色,流式细胞学分析显示,光热/声动力联合协同PD-1治疗组中有大量被激活的效应T细胞CD8+T细胞,其比例高于其他组,而调节性T细胞Treg的比例最低,具有统计学意义（P<0.05）。ELISA血清分析显示,实验组分泌了较多的细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-12,具有统计学意义（P<0.05）。4.CHINPs生物安全性评估:健康昆明鼠各组血常规和血生化各项指标结果均在正常参考值范围内,主要器官的H&E染色结果亦未见明显形态学及病理组织改变。结论CHINPs具有良好的生物相容性,可在808nm激光仪及低强度聚焦超声作用下,通过光热效应及产生ROS直接杀伤原发瘤,联合PD-1抗体激活全身免疫反应,从而有效抑制转移瘤的生长。