人工培养菌种茯苓菌丝体多糖的结构和生物活性

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茯苓长期用作传统中药,具有利尿、抗菌、免疫、抗肿瘤和补体激活等功效。多糖是优良的免疫调节剂,能抑制肿瘤或癌细胞的生长,并且对正常细胞无毒副作用,因而是很有前途的保健食品和天然新药。近年已发现多糖的抗肿瘤活性与其在溶液中的链构象有关,然而多糖的链构象主要依靠高分子溶液理论和方法确定,需要生物技术与高分子物理学相结合才可能完成。本工作主要采用液体深层培养技术培养得到茯苓菌丝体,并用生物技术从菌丝体中提取和纯化出水溶性和碱溶性多糖,然后研究它们的化学结构、溶液中的链构象和抗肿瘤活性。本论文利用高分子物理与生物技术结合研究茯苓菌丝体多糖构象与生物活性,属交叉学科领域。 本工作的主要创新点如下:(1)弄清用人工培养的菌种在含麸皮提取液和含玉米浆的两种培养基深层发酵培养的茯苓菌丝体中各种多糖的化学结构和分子量以及培养基的影响;(2)用光散射和粘度法测量并按照高分子溶液理论确定(1→3)-a-D-葡聚糖ab-PCM3-I及其硫酸酯衍生物S-ab-PCM3-I在二甲亚砜(DMSO)溶液和水溶液中分别呈现较为伸展的无规线团链构象和半刚性链构象:(3)弄清茯苓菌丝体胞外多糖的化学组成和分子量,并评价其体内和体外的抗Sarcoma 180肿瘤的活性。 本论文主要研究内容和结论概括如下。在含有玉米浆的液体培养基中采用深层发酵技术培养出茯苓菌丝体。菌丝体依次用0.9%NaCl水溶液、热水、0.5 M NaOH水溶液和88%甲酸提取,从中分离出六种多糖,分别标记为ac-PCM1、ac-PCM2、ac-PCM3-Ⅰ、ac-PCM3-Ⅱ、ac-PCM4-Ⅰ和ac-PCM4-Ⅱ,另外从培养液中得到一种胞外多糖ac-PCMO。红外光谱(IR)、13C-NMR、气相色谱(GC)及蛋白质和元素分析(EA)结果指出,ac-PCM1、ac-PCM2和ac-PCM0是杂多糖,单糖组成为葡萄糖、半乳糖、甘露糖和海藻糖,而ac-PCM3-Ⅰ和ac-PCM3-Ⅱ主要含有D-葡萄糖。随着提取过程的进行,各多糖组分中的葡萄糖含量逐渐增加。值得注意的是a-D-葡聚糖(ac-PCM3-Ⅰ)和β-D-葡聚糖(ac-PCM3-Ⅱ)共存于NaOH的碱水提取液中,并且用醋酸中和后可以将它们分开。用含有玉米浆的培养液培养分离出的多糖系列ac-PCM比用含有麸皮的培养液培养分离出的多糖系列ab-PCM含有更多的蛋白质。用激光光散射(LLS)、尺寸排除色谱和LLS联用(SEC-LLS)和粘度法测定了这些多糖的重均分子量(Mw)和特性粘数([η])。结果表明培养基中的玉米浆和麸皮对茯苓菌丝体多糖的化学组成、分子量和链构象有很大的影响。 茯苓菌丝体水不溶性(1→3)-a-D-葡聚糖(ab-PCM3-Ⅰ)采用沉淀分级法以0.25 M氯化锂/二甲亚砜(LiCl/DMSO)为溶剂、丙酮与0.25 M LiCl/DMSO(4:1)混合液为沉淀剂成功分成10个级分。其中7个分级试样用氯磺酸一吡啶复合物合成了水溶性的硫酸酯多糖,它们的取代度范围为0.35~0.81。用SEC-LLS和粘度法测得该多糖及其硫酸酯衍生物S-ab-PCM3-Ⅰ分别在0.25 M LiCl/DMSO和0.9%NaCl水溶液中25℃条件下的Mark-Houwink方程依次为:[η]=9.92×10-3Mw0.77(mL g-1)和[η]=
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