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目的探讨胰腺癌相关基因寡核苷酸芯片的制作及其在检测胰腺癌基因表达谱方面的应用,通过芯片杂交和荧光定量PCR初步验证胰腺癌相关基因芯片构建的可行性、可靠性及准确性,并对差异表达基因进行生物学分析,为研究胰腺癌的发病机制及早期诊断提供理论依据。方法利用MEDLINE、中国期刊全文数据库(CNKI)等多种文献数据库,有目的地筛选胰腺癌相关基因,通过Genbank数据库进行核实并获取有关基因信息,设计、合成寡核苷酸探针,用OmniGrid 100型点样仪将寡核苷酸探针点样于同型双功能偶联剂包被的(APS-PDC)基片上,制成寡核苷酸基因芯片,其中设置阳性、阴性及空白质控点16个。收集6例胰腺癌和3例正常胰腺组织标本,用TRIzol法进行组织总RNA抽提,并先后用无RNA酶的DNA酶I处理,QIAGEN RNeasy? Kit进行纯化,然后分别进行紫外分光光度计测定、琼脂糖凝胶电泳及Lab on chip对总RNA进行质控。将3例正常胰腺组织的总RNA混合作为共同对照。在cDNA第一链合成过程中,通过反转录酶将CyDye标记核苷酸直接渗入到cDNA中制备荧光探针,其中用Cy3-dCTP标记胰腺癌组织,Cy5-dCTP标记正常胰腺组织,用QIAquick PCR purification Kit进行荧光探针的纯化。将定量后Cy3和Cy5标记的探针用杂交液混合,置于PCR仪中95℃变性2 min,70℃预杂交20min后,滴加于芯片上,置杂交箱中42℃避光杂交16～18h。杂交完毕分别用洗液Ⅰ(2×SSC/0.1%SDS)、洗液II(1×SSC/0.1%SDS)、洗液Ⅲ(0.5×SSC)洗片各10min,离心干片。用Agilent扫描仪进行扫描,计算片间及片内重复相关系数、检出率及质控点变异系数平均值(CV值,%)。将图像导入图像分析软件Imagene3.0(Biodiscovery, Inc.),确定杂交点的范围,过滤背景噪音,提取基因表达的荧光信号强度值,并对Cy3和Cy5的原始信号进行均衡和修正,计算两种荧光Cy3与Cy5信号强度的比值。对杂交结果进行Ratio值比较和Cluster聚类分析。为验证芯片杂交结果的可靠性和准确性,挑选差异表达基因CDC25B、BRAF和TUSC3进行荧光定量PCR(Sybrgreen方法)验证,以beta-actin为内参照基因,按照Invitrogen RT-PCR kit操作程序进行PCR反应,PCR产物的定量方法采用比较Ct法。结果基因芯片构建及杂交结果:经过文献检索及Genbank核实后,共筛选出94个胰腺癌相关基因用于芯片制备。芯片杂交扫描图像背景均一且值很小,各点间距均匀相等,单元中心位于象素点上,所获图像具有较低的整体背景和较高的信噪比。各阳性质控点信号均匀一致,阴性质控点和空白点信号低,变异系数(CV值)变化小,片间及片内重复性均较好。经过Ratio值及Cluster聚类分析,与正常组织相比,胰腺癌组织中差异表达基因24条,占全部基因的25.5%,其中上调基因17条(占18.1%),下调基因7条(占7.4 %)。荧光定量PCR验证结果:用比较Ct法计算获得CDC25B、BRAF及TUSC3基因的起始模板浓度,该浓度即反映各基因在不同样本中的表达水平。BRAF基因平均模板量在正常组织中为0.0010167±0.00025,胰腺癌组织中为0.0026062±0.00109;CDC25B基因平均模板量在正常组织中为0.0006350±0.00021,胰腺癌组织中为0.001988±0.00065;TUSC3基因平均模板量在正常组织中为0.0387493±0.00965,胰腺癌组织中为0.0206028±0.00401。与正常胰腺组织相比,胰腺癌组织中BRAF基因表达上调2.56倍(P<0.05),CDC25B基因表达上调3.13倍(P<0.05),TUSC3基因下调1.88倍(P<0.05)。三种基因表达趋势与芯片实验的结果一致。结论制备的胰腺癌相关基因芯片,可同时、并行检测多种胰腺癌相关基因的表达改变,具有一定的特异性和灵敏性。胰腺癌组织与正常胰腺组织相比,基因表达谱具有明显的差异。CDC25B、BRAF及TUSC3等基因在胰腺癌中表达明显改变,可能与胰腺癌的发生、发展具有重要的关系,有望成为新的诊断标记或治疗靶点,值得进一步深入研究。