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本文探讨了不同基础培养液(mTCM-199、NCSU23)和PMSG、HCG浓度、作用时间对猪卵母细胞体外成熟的影响和乙醇、钙离子载体A23187单独处理或与各种化学试剂联合处理对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活、孤雌生殖胚胎发育的影响,最终找到了最佳的猪卵母细胞体外成熟培养体系,并确定了乙醇、钙离子载体A23187最佳激活方法。试验结果得出:
1.PMSG和HCG在猪卵母细胞体外成熟培养过程中可以显著提高核成熟率,在体外成熟培养22h后去除激素环境,不能提高核成熟率;NCSU23比mTCM-199更适合用做基础培养液;最佳的猪卵母细胞培养体系为:NCSU23+20IU/m1PMSG+20IU/mlHCG+10%PFF,激素作用时间为45h,成熟率达到70.31±3.94%。
2.乙醇的最佳激活卵子浓度为8%,最佳处理时间为10min,激活率和卵裂率分别N32.41±2.02%、9.82±2.07%,均显著高于对照组(p<0.05);乙醇与CB+CHX联合处理的激活率为60.83±3.22%,显著高于对照组和其他处理组(p<0.05);与CB+CHX联合处理的卵裂率为45.08±2.96%,极显著高于对照组(p<0.01),虽高于其他处理组,但与ET+CB(40.12±4.98%)、ET+CHX(37.47±2.26%)、ET+CB+6-DMAP(41.77±3.59%)三处理组差异不显著(p>0.05);与CB+6-DMAP联合处理的桑葚胚率为9.66±2.62%,极显著高于对照组和ET+CB处理组(0.00±0.00%、1.51±0.92%,p<0.01),虽高于ET+CHX、ET+6-DMAP、ET+CB+CHX处理组(6.34±1.56%、4.90±1.42%、8.26±2.56%),但差异不显著(p>0.05);最佳猪体外成熟卵子激活方法为:8%的乙醇处理10min后,再转入含CB+6-DMAP的NCSU23激活液中作用6h。
3.钙离子载体A23187的最佳激活浓度/时间处理组合为25μM/10min,卵裂率为30.81±6.13%,显著高于50μM/7min处理组(15.14±3.12%,p<0.05),极显著高于50μM/10min处理组(10.35±2.10%,p<0.01);钙离子载体A23187与CB+6-DMAP联合处理组的激活率为66.82±6.96%,极显著高于对照组(38.13±3.92%,p<0.01),显著高于A23187+CB处理组(47.30±6.02%,p<0.05),虽高于A23187+CHX、A23187+6-DMAP、A23187+CB+CHX三处理组,但差异不显著(56.75±2.80%、60.19±3.17%、59.81±2.91%,p>0.05);与6-DMAP联合处理组的卵裂率为46.26±5.55%,极显著高于A23187+CB处理组(23.40±1.92%,p<0.01),与对照组、A23187+CHX、A23187+CB+CHX、A23187+CB+6-DMAP三处理组差异不显著(36.72±3.44%、44.79±3.59%、40.22+2.71%、41.43±4.06%,p>0.05);钙离子载体A23187单独作用的桑椹胚率为19.25±2.71%,极显著高于A23187+CB处理组(4.76±1.40%,p<0.01),与A23187+CHX、A23187+6-DMAP、A23187+CB+CHX、A23187+CB+6-DMAP四处理组差异不显著(14.31±3.31%、10.00±3.68%、14.41±3.10%、10.66±2.53%,p>0.05);钙离子载体A23187最佳的激活方法为:25μM的钙离子载体A23187处理10min后,再转入胚胎培养液中继续培养。