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茶尺蠖是危害茶树的主要害虫之一,严重制约了茶叶的经济价值。咖啡碱是茶树叶片中含量最高的生物碱,对一般昆虫有毒。但茶尺蠖却在长期与茶树协同进化过程中,不仅可以吸收消化茶叶营养物质,还逐渐形成了代谢咖啡碱的特殊能力。已知的一些研究表明昆虫肠道微生物具有植物毒素及杀虫剂的解毒功能,但目前茶尺蠖肠道共生菌是否参与咖啡碱的解毒还不清楚。因此,本研究拟通过扩增子高通量测序技术和传统培养方法初步探讨茶尺蠖肠道菌群与咖啡碱解毒之间的关系。主要研究结果如下:1.通过扩增子高通量测序技术对饲喂不同饲料的茶尺蠖幼虫肠道菌群结构进行分析,结果表明,在门水平上,厚壁菌门Firmicutes和变形菌门Proteobacteria是CK组(不含咖啡碱人工饲料饲喂)和CF组(含0.5%咖啡碱人工饲料饲喂)肠道菌群相对丰度较高的两个门。经咖啡碱胁迫后,CF组的厚壁菌门相对丰度和CK组(88.04%)相比降到59.39%(P<0.005),而变形菌门相对丰度则由6.35%上升到20.11%(P<0.05)。在属水平上,CK组幼虫肠道内优势菌主要为肠球菌属Enterococcus(83.40%)、假单胞菌属Pseudomonas(1.10%)、魏斯氏菌属Weissella(0.71%),而CF组幼虫肠道优势菌主要是为肠球菌属Enterococcus(49.90%)、魏斯氏菌属Weissella(1.85%)、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas(1.41%)。肠球菌属Enterococcus虽是两组幼虫肠道内最主要的优势菌,但在咖啡碱胁迫后,其相对丰度由83.39%明显降低到49.90%(P<0.05)。除此以外,假单胞菌属的相对丰度也明显降低,而鞘氨醇单胞菌属相对丰度显著上升,成为优势菌属。由此可见,咖啡碱的胁迫对茶尺蠖幼虫肠道菌群组成的结构影响不大,但可在一定程度上改变菌群的相对丰度。扩增子高通量测序所得的OTU序列经均一化处理后统计发现,CF组幼虫肠道中共检测到3285个OTU,而CK组幼虫肠道仅检测到2085个OTU;对丰度较高的35个属的OTU进行聚类,热图结果表明,两组幼虫肠道细菌结构差异对比十分显著;这些分析结果均表明高浓度咖啡碱胁迫后致使茶尺蠖幼虫肠道菌群多样性显著提升。对两组肠道菌群进行多样性分析,发现CF组幼虫肠道菌群的Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和ACE指数均高于CK组,且两组之间存在显著差异(P<0.005;P<0.05;P<0.05;P<0.005),这表明高浓度咖啡碱胁迫显著增加了茶尺蠖幼虫肠道微生物的多样性和丰富度。2.通过传统分离纯化培养方法,利用选择培养基(以咖啡碱为唯一的碳氮源)从茶尺蠖幼虫肠道中分离到11株细菌和16株真菌。通过16S r DNA和ITS r DNA序列分析进行初步鉴定,发现11株细菌分别为布氏不动杆菌属Acinetobacter bouvetii、溶血性不动杆菌Acinetobacter haemolyticus、柠檬两面神菌Janibacter melonis、库克菌属Kocuria sp、异常球菌属Deinococcus sp.、芽孢杆菌属Bacillus sp.、嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophillia、细黄链霉菌Streptomyces microflavus、松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciuiri;16株真菌主要有青霉菌Penicillium sp.、普通青霉菌Penicillium commune、覃青霉Penicillium paxilli、马洛奇青霉菌Penicillium mallochii、产黄青霉菌Penicillium chrysogenum、桔青霉菌Penicillium citrinum、椰青霉菌Penicillium copticola、毛霉菌Mucor sp.、棘壳孢菌Pyrenochaeta unguis-hominis、淡紫紫孢菌Purpureocillicum lilacinum、绳状篮状菌Talaromyces funiculosus、杂色曲霉Aspergillus versicolor、人类枝孢菌Cladosporium anthropophilum、黄瓜球孢霉Plectosphaerella cucumerina。其中,菌株CF-FG与MH155323(Mucor sp.)比对相似度仅为82.88%,为潜在新种,需进行进一步研究。对菌株降解咖啡碱能力的检测发现,细菌降解咖啡碱能力较弱,而部分真菌能够一定程度地代谢咖啡碱。其中,菌株CF-F9 Penicillium sp.(36.31%),菌株CF-FF1 Penicillium mallochii(35.37%)和菌株CF-FF Penicillium paxilli(33.56%)的降解率相对较高。综上所述,本研究表明高浓度咖啡碱胁迫会显著增加茶尺蠖幼虫肠道菌群多样性及其丰度,茶尺蠖幼虫肠道共生微生物可能在一定程度上参与咖啡碱的代谢,能够协同提高宿主对咖啡碱的解毒作用,从而提高宿主的防御能力。