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酪蛋白磷酸肽（CPP）是一种能够有效促进机体对钙吸收利用的生物活性多肽,目前已成功作为食品添加剂添加至钙片、奶粉等产品中,促钙吸收效果良好,具有非常广阔的市场前景。本文在前人实验基础上,利用高效液相色谱成功富集得到酪蛋白磷酸肽活性单体P5;研发了一种新型检测酪蛋白磷酸肽含量的方法;同时对酪蛋白磷酸肽在体外化学和细胞、体内动物的促钙吸收活性进行评价,并利用Caco-2细胞模型对其促钙吸收的机制进行了初步的探索。主要研究内容及结果如下:开发了一种检测方法检测酪蛋白磷酸肽新方法---TiO2固相微萃取法。利用固相微萃取小柱准确吸附酪蛋白的酶解液中的磷酸肽即酪蛋白磷酸肽,并且设计了回收率和精确度实验,回收率可达97%,精确度的相对标准偏差达11.58%,重现性较好,灵敏度较高,可以特异地吸收样品中磷酸肽,从定性和定量的角度来检测酪蛋白磷酸肽含量。CPP体外持钙活性评价。在体外探索钙肽比、pH、温度和水浴时间四个单因素对酪蛋白磷酸肽体外持钙的影响,并且选取钙肽比、pH、温度和水浴时间为自变量,每个因素三个水平,以体外结合钙含量为指标,设计响应面试验,优化体外影响酪蛋白磷酸肽最佳条件。结果表明,最佳理论优化工艺条件修正为:钙肽比1:2、pH 8.2、温度40℃、水浴时间10 min,在此条件下进行3次平行实验,CPP体外平均结合钙含量9.32 mg。与理论预测值相比,其相对误差为3.58%,重复较好,优化结果可靠,表明响应面分析法可以用于CPP体外结合钙含量优化研究中。CPP体内代谢与活性评价。采用大鼠模型进行酪蛋白磷酸肽体内促钙吸收活性评价,结合稳定核素的方法,探索动物钙代谢吸收规律及组织化学定位。设计给予动物灌胃同位素42Ca和酪蛋白磷酸肽样品,在不同时间段取样,收集尿液和粪便,隔天收集脏器和血液样品。样品经湿法消化后,发现样品中含有大量的钾、钠等离子,造成光谱干扰,检测不准确。为此开发利用ME-1螯合小柱固相萃取42Ca,有效去除钾、钠等光谱干扰离子,再利用高分辨率的ICP-MS检测样品中同位素42Ca含量。同时利用高效液相色谱追踪酪蛋白磷酸肽的去向,为后续细胞实验作出铺垫。结果表明,经过多次优化实验,溶液中钙离子的保留率达到（95.00±5.00）%,钾离子去除率达到（93.00±4.25）%,钠离子去除率达到（87.65±11.35）%。动物实验研究结果表明,非放射性同位素钙可以用来表征动物体内钙的吸收代谢,明确把控其去向。同位素钙首先被小肠吸收到血液中,一部分进入组织液随之运输到各种器官中,另一部分的同位素钙不被吸收经尿液排出体外。同时,比较CPP1,CPP2,P5和标记钙组的总尿钙排泄量,表明CPP样品具有显著的促钙吸收效应,CPP样品组尿钙排出量明显低于空白对照,尤其是CPP活性单体组分P5,差异显著（P<0.05）。CPP促钙吸收机制初步探索。从Caco-2细胞实验结果来看,CPP样品组的荧光强度均高于正常钙摄取组和空白组,各个样品组之间差异显着（P<0.05）。实验结果与动物实验研究结果一致,P5活性单体具有最强的钙吸收能力,在30min时,细胞内钙离子的荧光强度达到最高点,然后保持稳定,表明溶液中的所有钙离子在30 min内进入细胞,达到饱和状态。同时,通过该实验可以表明了CPP在促钙吸收过程中,发生了主动运输机制,即钙离子穿透细胞膜进入细胞。另外,通过Caco-2细胞模型也发现了CPP在跨膜运输过程中,不会被细胞产生的酶系酶切,CPP以完整的肽段存在溶液中或者进入细胞中,但不会跨膜至底端。从WESTERN BLOTTING实验结果来看,通过分析样品密度比值可知,CPP-H及CPP-P5促进细胞膜上的通道蛋白TRPV5和TRPV6表达量明显高于空白组,表明了CPP在促钙吸收过程中,发生主动运输,细胞膜上的通道蛋白的表达量增多,实现了钙离子较快较多地进入细胞中。