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第一章血根碱抑制胶原诱导的血小板活化及抗动脉血栓作用和机制研究目的:血管内皮损伤暴露的胶原可刺激血小板激活导致动脉血栓的形成,抑制血小板活化是抗动脉血栓的核心策略。有研究报道异喹啉类天然化合物血根碱具有抗血小板活化的作用,但对其抗动脉血栓的作用和抗血小板活化的具体机制并未深入探讨。本研究主要从抑制胶原引起的血小板功能活化的角度来探讨血根碱抗动脉血栓的作用,并分析其具体的分子机制。方法:建立FeCl3诱导的小鼠颈动脉血栓模型,多普勒血流仪用于评价血根碱对小鼠颈动脉血栓形成时间的影响;采用Bioflux微流控系统评价血根碱对高剪切力下血小板在胶原基质上粘附的影响;应用血小板聚集仪观察血根碱对胶原及其类似物胶原相关肽CRP诱导血小板聚集及致密颗粒释放的影响;利用流式细胞术检测血根碱对胶原诱导血小板激活时膜上P-selectin的表达和PAC-1的结合率以及胞内Ca2+浓度（[Ca2+]i）的影响;应用荧光显微镜观察血根碱对血小板在固化纤维蛋白原上扩展功能的影响;采用Western blot分析血根碱对血小板的主要信号通路蛋白磷酸化的影响。结果:（1）体内和体外实验均证实血根碱可以剂量依赖性地抑制动脉血栓的形成。（2）血根碱剂量依赖性地抑制了胶原及CRP诱导的血小板聚集和致密颗粒释放。（3）血根碱剂量依赖性地抑制胶原引起的血小板膜上P-selectin的表达和PAC-1的结合,抑制胶原诱导的血小板胞内Ca2+浓度（[Ca2+]i）增加。（4）血根碱显著抑制血小板在固化纤维蛋白原上的扩展。（5）Western blot分析发现血根碱显著了抑制胶原特异性GPVI受体通路下游信号分子包括Syk、PLCγ2、PI3K、Akt、GSK3β的磷酸化水平;血根碱还显著降低由整合素αIIbβ3介导的“由外向内”信号通路中的β3和Src磷酸化水平。结论:血根碱通过显著抑制胶原对血小板功能的影响（包括聚集、释放、扩展和黏附）,而实现抗动脉血栓形成的作用。分子机制主要包括:（1）抑制胶原特异性GPVI受体信号通路;（2）抑制胶原诱导的血小板胞内Ca2+浓度增加;（3）负性调节血小板膜上整合素αIIbβ3介导的“由外向内”信号转导。第二章血根碱通过抑制静脉血栓中血小板来源的HMGB1抗DVT作用的研究目的:深静脉血栓（Deep vein thrombosis,DVT）是一种多发性疾病,其并发症构成了相当高的死亡率和医疗负担。研究表明DVT的形成是无菌性炎症反应,血小板来源的HMGB1在此过程中发挥了重要作用。本研究主要探讨血根碱抗DVT的作用,并从抑制静脉血栓中血小板来源的HMGB1的角度来分析其药理作用机制。方法:建立小鼠IVC狭窄模型评价血根碱对DVT的成栓率和静脉血栓大小的影响;采用免疫组化和免疫荧光观察血根碱对小鼠静脉血栓里中性粒细胞的浸润和NETs形成的影响;应用免疫组化观察血根碱对血栓组织中的炎性因子和HMGB1表达的影响;免疫荧光三染色观察血根碱对血栓中血小板的募集以及血小板源性的HMGB1表达的影响;利用流式细胞分选仪分选纯化血根碱处理组及对照组小鼠巨核细胞,RT-PCR检测血根碱对小鼠巨核细胞和血小板里HMGB1的m RNA表达的影响,Western blot检测HMGB1蛋白表达的变化;利用流式细胞术检测血根碱对小鼠IVC狭窄模型血小板膜上P-selectin的表达和JON/A结合率的影响,以及血根碱对激动剂活化血小板时膜上PS和HMGB1的共定位表达的影响;ELISA检测血根碱对激动剂诱导血小板释放HMGB1的影响;采用分子对接模拟软件Autodock推测血根碱和TLR4受体的分子对接位点和亲和力;应用TLR4-/-小鼠造IVC狭窄模型评价血根碱作为潜在的TLR4配体发挥抗DVT的作用;应用TLR4-/-小鼠评价血根碱作为潜在的TLR4配体对其巨核细胞和血小板中HMGB1、MYD88和NFκB p65的m RNA表达调控;采用人巨核细胞系Meg-01细胞评价血根碱通过TLR4-NFκB通路调控HMGB1的蛋白合成。结果:（1）血根碱剂量依赖性抑制小鼠IVC狭窄模型静脉血栓形成。（2）血根碱减少了静脉血栓中中性粒细胞的浸润和NETs的形成。（3）血根碱特异性减少了静脉血栓中HMGB1表达,而对IL1β、IL6和TNFα的表达无影响。（4）血根碱抑制了静脉血栓中血小板来源的HMGB1。（5）血根碱通过抑制巨核细胞里HMGB1的m RNA和蛋白表达从而减少血小板里HMGB1的含量。（6）血根碱抑制了激动剂所致的血小板HMGB1的上膜及释放。（7）血根碱作为TLR4受体的潜在配体参与了DVT的抑制作用。（8）血根碱抑制了小鼠巨核细胞和血小板中HMGB1、MYD88和NFκB m RNA的表达。（9）血根碱通过抑制TLR4-NFκB来调控Meg-01细胞中HMGB1的蛋白表达。结论:血根碱抑制了血栓中血小板来源的HMGB1而实现抗DVT作用,并作为潜在的TLR4受体阻断剂调控TLR4-MYD88-NFκB信号通路来抑制巨核细胞中HMGB1的m RNA和蛋白的表达。