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第一章三氧化二砷对急性哮喘小鼠气道高反应性及气道炎症的影响目的(1)建立急性哮喘小鼠模型,并鉴定建立的模型是否成功；(2)观察三氧化二砷对急性哮喘小鼠气道高反应性及气道炎症的影响。方法将30只SPF级BALB/c雌性小鼠随机分为三组：正常组(PBS组)、哮喘组(OVA/PBS组)和三氧化二砷组(OVA/ATO组),每组10只。所有小鼠适应性饲养一周后按以下方法建立急性哮喘小鼠模型。PBS组于第1、13天经腹腔注射PBS缓冲液(PH7.2-7.4)0.2ml,第19-24天连续6天每天予以6ml PBS缓冲液(PH7.2-7.4)雾化30min,每次雾化前30min予以腹腔注射PBS缓冲液(PH7.2-7.4)0.2ml; OVA/PBS组于第1、13天经腹腔注射OVA与氢氧化铝凝胶的混合溶液(10μgOVA(GradeV)和2mg氢氧化铝凝胶溶于PBS缓冲液中,充分混匀)0.2ml,第19-24天连续6天每天予以5%OVA (GradeV)溶液6ml雾化30min,每次雾化前30mmin予以腹腔注射PBS缓冲液(PH7.2-7.4)0.2ml; OVA/ATO组于第1、13天腹腔注射OVA与氢氧化铝凝胶的混合溶液(10μg OVA(GradeV)和2mg氢氧化铝凝胶溶于PBS缓冲液中,充分混匀)0.2ml,第19-24天连续6天每天予以5%OVA (GradeV)溶液6ml雾化30min,每次雾化前30mmin予以腹腔注射三氧化二砷溶液(用量：2.5mg/kgx小鼠体重,配成0.2ml溶液)。第25天处理所有小鼠,检测以下指标：(1)对小鼠的一般行为活动进行观察；(2)不同浓度的乙酰甲胆碱激发小鼠后,采用有创肺阻抗法测定小鼠的气道反应性；(3)收集BALF行细胞计数及分类；(4)肺组织病理切片观察炎症细胞浸润及黏液分泌情况。计量资料以均数±标准差(x±S)表示。各组数据先行正态检验和方差齐性检验,如果数据不符合正态分布,则经自然对数转换为正态分布的数据。若数据方差不齐,则行Dunnett’s T3法。多组均数间比较采用单因素方差分析(Analysis of Variance, ANOVA),各组间两两比较采用LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。结果实验前：各组小鼠的外观、行为、对刺激的反应、活动及体重均无明显差异。致敏阶段：各组小鼠的腹腔注射部位无红肿、溃烂。激发阶段：PBS组小鼠饮食正常,活动灵敏,皮毛清洁有光泽,OVA/PBS组小鼠早期出现兴奋、打喷嚏、抓耳挠腮,后期出现匍匐不起、嗜睡症状,OVA/ATO组小鼠出现打喷嚏、兴奋的症状较OVA/PBS组轻,无嗜睡症状。而且,实验全程OVA/ATO组小鼠没有活动减少、厌食、体重减轻等异常症状。OVA/PBS组小鼠气道反应性较PBS组显著增高(P<0.05)；而OVA/ATO组小鼠气道反应性较OVA/PBS组明显降低(P<0.05)。OVA/PBS组小鼠BALF中白细胞总数为21.11±3.28×104/ml、嗜酸性粒细胞数为3.10±0.50×104/ml、淋巴细胞数为6.60±0.97×104/ml、中性粒细胞数为4.92±0.45×104/ml,较PBS组均显著增加(均P<0.01)；OVA/ATO组BALF中白细胞总数为13.04±2.58×104/ml、嗜酸性粒细胞数为1.06±0.19×104/ml、淋巴细胞数为2.43±0.28×104/ml、中性粒细胞数为2.36±0.29×104/ml,较OVA/PBS组均明显降低(均P<0.01)。与PBS组相比,OVA/PBS组小鼠肺组织大量炎症细胞浸润、杯状细胞增生、气道分泌大量黏液(P<0.01); OVA/ATO组气道炎症和黏液分泌状态较OVA/PBS组有所减轻(P<0.05)。结论(1)本实验中建立的急性哮喘小鼠模型是成功的；(2)三氧化二砷能减轻急性哮喘小鼠的气道高反应性及气道炎症。第二章三氧化二砷诱导急性哮喘小鼠CD4+T细胞凋亡目的检测三氧化二砷干预对急性哮喘小鼠CD4+T细胞凋亡的影响。方法在体部分：将18只SPF级BALB/c雌性小鼠随机分为三组：正常组(PBS组)、哮喘组(OVA/PBS组)和三氧化二砷组(OVA/ATO组),每组6只,按第一章中的方法建立急性哮喘小鼠模型,第25天处理小鼠,利用免疫磁珠分离纯化各组小鼠脾CD4+T细胞,计数CD4+T细胞总数,然后用完全性RPMI-1640培养基按2×106cell/ml的浓度接种细胞,同时加入ConA (5ug/ml)进行刺激,置于培养箱中培养24h,用流式细胞术检测细胞的凋亡率。离体部分：免疫磁珠分离纯化OVA/PBS组小鼠脾CD4+T细胞,然后用完全性RPMI-1640培养基按2×106cell/ml的浓度接种细胞,加入ConA (5ug/ml)进行刺激,同时分别加入四组不同浓度的三氧化二砷溶液(0μM,1μM,3μM,5μM)培养20小时,用流式细胞术检测细胞的凋亡率。计量资料以均数±标准差(x±S)表示。各组数据先行正态检验和方差齐性检验,如果数据不符合正态分布,则经自然对数转换为正态分布的数据。若数据方差不齐,则行Dunnett’s T3法。多组均数间比较采用单因素方差分析(Analysis of Variance, ANOVA),各组间两两比较采用LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。结果在体部分：OVA/PBS组小鼠脾CD4+T细胞总数为(17.88±2.13)×108/L,较PBS组显著增多(P<0.01)；OVA/ATO组小鼠脾CD4+T细胞总数为(12.92±2.31)×108/L,较OVA/PBS组显著减少(P<0.05)。OVA/PBS组CD4+T细胞的凋亡率为20.69±2.68%,较PBS组显著下降(P<0.05)；OVA/ATO组CD4+T细胞的凋亡率为34.71±0.98%,较OVA/PBS组显著升高(P<0.05)。离体部分：3μM组CD4+T细胞的凋亡率为31.85±3.73%,较0μM组显著升高(P<0.05)；5μM组CD4+T细胞的凋亡率为40.54±1.99%,较0μM组和3μM组均显著升高(P<0.01和P<0.05)。结论三氧化二砷诱导急性哮喘小鼠CD4+T细胞的凋亡。第三章内质网应激-CHOP途径参与三氧化二砷诱导CD4+T细胞的凋亡目的(1)探讨三氧化二砷干预对CD4+T细胞GRP78和CHOP蛋白表达的影响；(2)探索CHOP蛋白在三氧化二砷诱导CD4+T细胞凋亡中的作用。方法第一部分：免疫磁珠分离纯化第一章中已建模成功的OVA/PBS组小鼠脾CD4+T细胞,体外加入5μM三氧化二砷,分别培养0h,2.5h,5h,7.5h后,检测蛋白GRP78. CHOP的表达。第二部分：将OVA/PBS组小鼠脾CD4+T细胞分成两组：CHOP siRNA组和control siRNA组。首先,用可以沉默CHOP表达的CHOP siRNA和无沉默效果的对照片段contol siRNA分别转染两组CD4+T细胞,转染成功后,用real-timePCR和western blot分别检测两组CHOP mRNA和蛋白的表达,评估siRNA的沉默效果,达到满意效果后加入5μM三氧化二砷培养20h,检测各组细胞的凋亡率。计量资料以均数±标准差(x±S)表示。各组数据先行正态检验和方差齐性检验,如果数据不符合正态分布,则经自然对数转换为正态分布的数据。若数据方差不齐,则行Dunnett’s T3法。两组均数间比较采用独立样本t检验,多组均数间比较采用单因素方差分析(Analysis of Variance, ANOVA),各组间两两比较采用LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。结果ATO干预2.5h组,5h组,7.5h组GRP78蛋白的相对表达量较0h组均显著增多(分别是P<0.05,P<0.01,P<0.05)；5h组GRP78蛋白的相对表达量较2.5h组和7.5h组均显著升高(均P<0.05)；而2.5h组GRP78蛋白的相对表达量与7.5h组之间未见明显组间差异(P>0.05)。ATO干预5h组CHOP蛋白的相对表达量较0h组、2.5h组和7.5h组均显著增多(均P<0.05)；CHOP siRNA组CHOP mRNA和蛋白的表达量较control siRNA组均显著下降(均P<0.01)；予以ATO干预后CHOP siRNA组CD4+T细胞的凋亡率为32.39±2.30%,较control siRNA组显著下降(P<0.05)。结论(1)三氧化二砷能影响CD4+T细胞中GRP78蛋白和CHOP蛋白的表达；(2)转染CHOP siRNA能沉默CHOP蛋白的表达,并能部分阻断三氧化二砷诱导的CD4+T细胞的凋亡；(3)内质网应激-CHOP途径参与三氧化二砷诱导的CD4+T细胞的凋亡。