荧光互相关光谱技术(FCCS)是由荧光相关光谱(FCS)发展而来的一种单分子检测方法,由于该方法采用了双色荧光标记,显著地提高了方法的灵敏度和选择性。该方法可用于均相生物分析,分子的相互作用研究和原位分子动力学行为的研究。然而,传统FCCS方法需要两个不同波长的激光器为激发源,检测系统较为复杂,光路调节难度大。另外,双激光也会增加实验成本。本论文首先利用荧光半导体量子点(QDs)具有单颗粒亮度高、激发波长宽等特点,与荧光染料组合,用于荧光标记探针,构建了单波长激发荧光互相关光谱(SW-FCCS)检测系统。进而,基于SW-FCCS理论,将银纳米粒子(SNPs)的散射光和荧光染料的荧光进行结合,我首次提出了散射和荧光互相关光谱新模式(SFCCS)。基于FCCS系统,发展了高灵敏、高选择性的均相免疫分析新方法,用于肿瘤标志物的分析。本论文研究内容主要包括:1.使用毛细管电泳方法(CE)和FCS技术系统地研究了QDs和不同生物大分子之间的偶联反应。同时,使用体积排阻色谱法(SEC),荧光光谱和FCS方法研究分离纯化过程中QDs生物复合物的纯化效率和稳定性。在生物偶联过程中,使用的偶联试剂为乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)。系统研究QDs生物偶联反应中的诸多影响因素,如蛋白质的等电点(pI)和反应溶液的pH,并发现QDs与蛋白质的偶联反应中,蛋白质的pI显著影响偶联效率。通过优化偶联反应溶液的pH值,在使用EDC和Sulfo-NHS作为偶联试剂的条件下,具有不同pI的蛋白质均可以有效地与QDs偶联。另外,研究表明使用此种偶联方法得到的生物复合物在磷酸缓冲溶液中可以至少稳定存在5天。在纯化操作中,使用实验室自己填装的SEC凝胶柱,系统研究了凝胶柱规格、上样体积、洗脱液和不同凝胶介质对于纯化QDs生物复合物的影响。建立了一种简单有效的纯化QDs生物复合物方法,在优化的条件下进行两次SEC操作,可以得到高纯度、单分散的QDs生物复合物,为后续SW-FCCS方法研究奠定了实验基础。2.构建了SW-FCCS系统,对检测系统进行优化,提高了系统的灵敏度和稳定性。并且基于SW-FCCS,发展了一种灵敏度高、分析速度快的均相检测血清样品中癌症标志物的免疫新方法。以QDs和荧光染料作为荧光标记物,以AFP抗体抗原为模型,构建了均相竞争免疫和均相夹心免疫分析方法。对免疫反应的条件如温育温度、免疫反应时间、免疫复合物的稳定性、免疫反应物的浓度以及血清的自荧光现象均进行了优化。同时,将一种聚集体去除方法引入到信号处理方法中,提高了分析结果的准确性。在去除了大的聚集体信号后,可以得到正常免疫反应产生的低聚抗体抗原复合物的信号。在优化的条件下夹心免疫模型的检测线性范围为20 pM-5.0nM,检测限为20 pM;竞争免疫模型的检测线性范围为180 pM-15.0 nM,检测限为180 pM。夹心免疫模型的检测限明显低于使用相同甲胎蛋白抗体商品化的ELISA检测试剂盒的检测限(72 pM)。此方法可以直接检测癌症病人血清中AFP的含量,其结果与ELISA检测结果基本吻合。3.基于FCCS的理论,首次构建了散射和荧光互相关光谱新方法(SFCCS)。利用SFCCS系统研究了不同距离和模型下SNPs对于Alexa Fluor 488标记蛋白质荧光强度的影响,并且将SFCCS模型成功应用于免疫分析检测。在优化条件下,均相竞争免疫反应模型的线性检测范围为116pM-3.0 nM,检测限为116 pM。均相夹心竞争免疫反应模型的线性检测范围为23 pM-15.0 nM,检测限为23 pM。均相夹心免疫反应模型的线性检测范围为930 fM-580 pM,检测限为930 fM。最后使用该系统对血清样品中的AFP含量进行了测定。测定结果与ELISA检测结果基本吻合。此方法具有灵敏度高、重现性好、稳定性好、分析时间短等优点。SFCCS系统可以同时检测混合体系中的散射和荧光信号,并且通过计算可以得到两种信号之间的相关性。这使得SFCCS系统在混合体系中,如细胞膜或细胞内环境下的应用会有更广阔的前景。