论文部分内容阅读
目的:Lewis寡糖抗原是细胞表面糖复合物(糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖)中的糖链成分,已经发现其在多种肿瘤中的合成异常增加,与肿瘤增殖、浸润、转移、临床分期及预后密切相关。大量的研究发现,Lewis X(LeX)/Lewis Y(LeY)抗原在膀胱癌、胃癌、大肠癌、皮肤癌等癌细胞中均有较高表达,LeX/LeY的表达水平也因此作为评价恶性肿瘤性疾病恶性程度的重要指标,并对肿瘤的诊断、治疗以及预后判定提供帮助。研究表明,通过抗体封闭LeY,可以降低肿瘤细胞恶性程度,影响其恶性生物学行为。然而,是否能够通过RNAi技术干涉肿瘤细胞特异的岩藻糖基转移酶的合成和表达,降低肿瘤LeX/LeY寡糖抗原的合成,在基因水平抑制肿瘤的增殖、浸润和转移,目前国内外尚未见报道。本实验将有利于探讨肿瘤的糖分子病理学机制,为肿瘤的靶向基因治疗提供新的思路和手段。方法:1、应用FUT1和FUT4的各2个SiRNA干扰质粒,采用脂质体介导的方法对人子宫颈上皮癌细胞A431进行瞬时转染。2、流式细胞术检测LeX和LeY表达率。3、克隆形成实验评估细胞增殖能力。4、流式细胞术检测细胞周期分布。5、应用AnnexinⅤ/PI双标记的方法,检测A431细胞凋亡。6、流式细胞术检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达。结果:1、FUT1和FUT4的RNA干涉抑制A431细胞表面LeX/LeY表达。流式细胞仪检测转染后细胞表面LeX合成水平,表达率为FUT1-1(51.29±0.98)%、FUT1-2(47.30±0.93)%、FUT4-1(44.59±1.99)%、FUT4-2(43.82±0.48)%,明显低于对照组(92.09±2.49)%和空载体组(84.57±1.38)%(p<0.01);LeY的表达率为FUT1-1(28.34±1.01)%、FUT1-2(29.33±0.99)%、FUT4-1(35.11±1.57)%、FUT4-2(41.50±1.03)%,明显低于对照组(81.36±1.07)%和空载体组(74.84±0.84)%(p<0.01)。2、FUT1和FUT4的RNA干涉使细胞生长受明显抑制。克隆形成实验显示,转染组克隆形成率为FUT1-1(11.73±0.62)%、FUT1-2(13.33±0.61)%、FUT4-1(8.53±0.61)%、FUT4-2(6.80±0.80)%,明显低于对照组(22.80±0.80)%和空载体组(18.93±1.29)%(p<0.01)。3、FUT1和FUT4的RNA干涉使细胞周期阻滞于S期。细胞周期分析显示,转染组细胞周期中G0/G1期比例为FUT1-1(40.83±0.03)%、FUT1-2(37.20±0.63)%、FUT4-1(40.68±0.04)%、FUT4-2(42.79±0.45)%,明显低于对照组(50.69±0.39)%(p<0.01),但与空载体组(42.82±1.62)%比较无明显差异;S期比例为FUT1-1(57.49±0.09)%、FUT1-2(61.89±0.50)%、FUT4-1(58.38±0.17)%、FUT4-2(55.73±0.60)%,明显高于对照组(34.11±0.61)%和空载体组(41.85±0.24)%(p<0.01);G2/M期比例为FUT1-1(1.67±0.11)%、FUT1-2(0.91±0.25)%、FUT4-1(0.94±0.19)%、FUT4-2(1.49±0.49)%,明显低于对照组(15.20±0.29)%和空载体组(16.26±0.99)%(p<0.01)。4、FUT1和FUT4的RNA干涉诱导A431细胞发生凋亡。经流式细胞术检测,转染组细胞凋亡率为FUT1-1(43.82±0.47)%、FUT1-2( 30.11±0.56) %、FUT4-1(49.35±0.47)%、FUT4-2(60.76±0.57)%,明显高于对照组(4.99±0.07)%和空载体组(7.99±3.76)%(p<0.01)。5、FUT1和FUT4的RNA干涉使Bcl-2表达下调及Bax表达上调。流式细胞术分析表明,转染组Bcl-2的表达率为FUT1-1(1.98±0.26)%、FUT1-2(3.16±0.29)%、FUT4-1(1.98±0.14)%、FUT4-2(1.46±0.07)%,明显低于对照组(11.64±1.01)%和空载体组(7.44±1.23)% (p <0.01);Bax的表达率为FUT1-1(20.36±0.88)%、FUT1-2(13.60±2.25)%、FUT4-1(21.43±0.97)%、FUT4-2(18.47±0.79)%,明显低于对照组(5.93±0.25)%和空载体组(7.41±1.23)%(p<0.01)。结论:FUT1和FUT4的RNA干涉能够降低A431细胞表面寡糖抗原LeX/LeY合成;影响A431细胞的增殖,使细胞周期阻滞于S期;诱导A431细胞发生凋亡。并使凋亡相关蛋白Bcl-2表达下调以及Bax表达上调。