【摘 要】
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麦角硫因作为一种天然氨基酸,是生物体内重要的活性物质,近年来因其具有较强的抗氧化特性,受到了广泛关注,逐渐在食品、化妆品、医药等领域崭露头角。人和动物体不可合成,但可吸收,食用菌是目前发现最有潜力合成麦角硫因的菌种,然而麦角硫因在食用菌中的合成途径目前尚不清楚,当前关于麦角硫因合成途径的研究主要集中在少数微生物上。因此,明确食用菌中麦角硫因的代谢途径具有重要意义,本文以白色金针菇（Flammuli
【基金项目】
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国家重点研发计划课题子任务“果蔬后熟衰老与品质变化的基础及精准保鲜技术”（编号:2016YFD0400901）；
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麦角硫因作为一种天然氨基酸,是生物体内重要的活性物质,近年来因其具有较强的抗氧化特性,受到了广泛关注,逐渐在食品、化妆品、医药等领域崭露头角。人和动物体不可合成,但可吸收,食用菌是目前发现最有潜力合成麦角硫因的菌种,然而麦角硫因在食用菌中的合成途径目前尚不清楚,当前关于麦角硫因合成途径的研究主要集中在少数微生物上。因此,明确食用菌中麦角硫因的代谢途径具有重要意义,本文以白色金针菇（Flammulina velutipes）为试验材料,分别用5,10,15mmol/L的组氨酸和15,20,30mmol/L的蛋氨酸及15,20,30mmol/L的半胱氨酸溶液浸泡金针菇,浸泡时间为20min,浸泡结束后自然晾干,于低温（2-3℃）条件下贮藏,通过检测贮藏过程中麦角硫因含量的变化来研究三种氨基酸处理对金针菇中麦角硫因含量的影响,进一步筛选出最佳处理浓度。之后对麦角硫因含量差异显著的金针菇样品进行转录组测序,旨在筛选出与麦角硫因代谢相关的酶基因,最后通过实时荧光定量PCR技术检测三种氨基酸的最佳浓度处理组金针菇的麦角硫因代谢关键酶基因在贮藏过程中的表达量及其变化情况。主要研究结果如下:1、浓度为15mmol/L、20mmol/L、30mmol/L的半胱氨酸溶液对金针菇采后麦角硫因的合成均有着很好的促进作用;蛋氨酸处理也能明显提升其含量,其中30mmol/L的蛋氨酸溶液处理效果较佳;低浓度组氨酸（5mmol/L）处理有助于金针菇采后麦角硫因的合成,中高浓度（10mmol/L、15mmol/L）处理会抑制其在贮藏中后期（8-14天）的合成,推测外源组氨酸处理会抑制金针菇内源组氨酸合成麦角硫因的过程;半胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸处理均能影响金针菇采后麦角硫因的合成代谢。2、应用新一代高通量测序技术对金针菇子实体进行转录组测序（RNA-seq）,获得转录组信息。通过Illumina Hiseq2000平台测序,经过Trinity软件对测序序列的拼接,总共得到28738551条clean reads,49540 条 contig,20020 个非冗余的 Unigene。Unigene 的 N50 达到2497bp,其平均长度为1435.49,GC含量为51.3 1%。Unigene功能注释,注释到 NR,Swiss-Prot,KOG,KEGG,GO 库的 Unigene 分别是14259个,14232个,6433个,7436个,11448个,所有注释上的Unigene是14298个。被注释的金针菇Unigene共分为25个类,涉及48个代谢通路和59种生物功能,对后续相关基因表达量的研究提供了大量数据。3、通过转录组注释信息及差异基因筛选,检测到了 4种与金针菇采后麦角硫因合成代谢相关酶基因的存在及转录（egtB,egt-2,egtA-1,egtA-2）,其中有两个基因序列均注释为egtA,故记为egtA-1和egtA-2,确定了 3种相关酶的存在:（1）Fe2+依赖性酶（EgtB;gamma-glutamyl hercynylcysteine S-oxide synthase）;（2）γ-谷氨酰基半胱氨酸连接酶（EgtA;glutamate---cysteine ligase）;（3）5-磷酸吡哆醛依赖性 β-裂合酶（Egt-2;pyridoxal 5-phos-phate（PLP）-dependent-lyase）。4、20mmol/L半胱氨酸处理和30mmol/L蛋氨酸处理对金针菇中egtB基因的相对表达量均有明显提升,最高可分别达到对照的418倍和32倍,推测半胱氨酸和蛋氨酸处理组麦角硫因的提升极有可能与egtB的高表达有直接关系,EgtB酶有可能直接参与了金针菇采后麦角硫因的合成代谢,而EgtB是分枝杆菌合成麦角硫因的五步合成途径中的关键酶之一,推测金针菇中极有可能存在与分枝杆菌中类似的麦角硫因合成途径。egt-2基因相对表达量相比对照也有所提升,推测外源氨基酸调控金针菇中麦角硫因的代谢可能也跟egt-2基因的表达有关。三个处理组的egtA-1和egtA-2基因相对表达量始终处于较低水平,说明三种处理对金针菇采后麦角硫因代谢的影响与egtA-1、egtA-2基因的表达没有直接关系,并非是诱导了这两种基因的表达而引起的,可能还存在其他未知的相关基因。
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