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目的:探讨微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)在牙周炎组织中表达水平的改变,并研究miR-34a在人牙周膜细胞炎症反应、增殖及成骨分化过程中的作用。本研究分为以下四个部分:第一部分miR-34a在正常和牙周炎组织中的表达收集26颗临床诊断为牙周炎而拔除的患牙根中部1/3的牙周膜组织;并收集5颗因正畸或阻生需要拔除的牙周健康、无龋坏的正常前磨牙或第三磨牙根中1/3的牙周膜组织,混合之后作为一个正常对照样本。提取组织RNA,采用实时荧光定量 PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测 miR-34a 及 miR-34a 的靶基因 Notch1、沉默调节因子 1(Silent information regulator 1,SIRT1)mRNA 的表达。qRT-PCR结果显示:miR-34a能够在人正常牙周膜组织中表达,并且在26例牙周炎组织标本中,miR-34a的表达水平(1.3418±0.1663)较正常牙周组织中的表达(0.9988±0.0118)升高,差异具有统计学意义(p<0.05);SIRTImRNA在牙周炎组织中的表达水平(0.5327±0.0451)较正常牙周组织(1.0013±0.0107)明显降低,Notch1mRNA在牙周炎组织中的表达(0.5768±0.0595)较正常组织(1.0032±0.0161)明显降低,差异均具有统计学意义(p<0.001)。第二部分miR-34a在LPS诱导的人牙周膜细胞炎症反应中的作用体外分离培养人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs),取第3～6代用于实验。首先,以1μg/ml大肠杆菌脂多糖(E.coli LPS)刺激hPDLCs不同时间(3、6、12h)和以不同浓度(0.01、0.1、1、10μg/ml)E.coliLPS 刺激3h,检测miR-34a的表达变化。然后,构建慢病毒载体pCDH-pre-miR-34a和pCDH,将慢病毒载体感染hPDLCs,构建稳定过表达miR-34a的人牙周膜细胞模型(hPDLCs/34a)和空载体对照细胞模型(hPDLCs/pCDH)。以E.coliLPS刺激后,qRT-PCR 检测 IL-6、IL-1β 及 TNF-α 等炎性因子及 Notch1、SIRT1 mRNA 的表达,以分析miR-34a对牙周膜细胞炎症反应的影响。结果:1)1μg/mlE.coliLPS刺激不同时间后,miR-34a的表达略有升高,在LPS刺激3h时,miR-34a的表达水平达最高峰,为对照组的1.36倍,差异具有统计学意义(p<0.01)。Notch1的表达在各时间点均显著降低,SIRT1的表达仅在刺激12h时略有增高,其余时间点未见明显改变。2)不同浓度LPS刺激3h后,除了 10μg/ml组miR-34a的表达没有明显改变外,0.01、0.1、1μg/ml三组miR-34a的表达明显升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。Notch1的表达均明显降低;SIRT1的表达除在1ug/ml时略有降低,其余浓度均略增高。3)1μg/mlE.coliLPS 刺激不同时间后,相比于 hPDLCs/pCDH,hPDLCs/miR-34a组IL-6的表达在刺激3、6及12小时后略增高,IL-1β在各时间点均显著增高,TNF-α在3小时显著增高,差异均具有统计学意义(p<0.05)。hPDLCs/34a细胞内Notch1的基础表达量降低,LPS刺激3h时较hPDLCs/pCDH略有增高,差异有统计学意义。SIRT1mRNA的表达变化不明显。4)不同浓度E.coli LPS刺激3小时,与hPDLCs/pCDH相比,除了 LPS浓度为0.1μg/ml组IL-6的相对表达量几乎没有改变外,其余各组三种细胞因子的表达量在hPDLCs/34a中均明显增高,差异具有统计学意义(p<0.05)。Notch1及SIRT1在hPDLCs/34a中的表达较hPDLCs/pCDH组略有增高。第三部分miR-34a过表达对hPDLCs增殖的影响如第二部分所述,构建hPDLCs/34a及hPDLCs/pCDH细胞,CCK-8法检测miR-34a过表达对细胞增殖的影响。CCK-8检测结果显示:与hPDLCs/pCDH相比,hPDLCs/34a的增殖能力从第2天开始受到明显抑制;随着培养时间的延长,hPDLCs/pCDH与hPDLCs/34a的增殖能力都在逐渐增强,但hPDLCs/34a的增殖能力始终弱于hPDLCs/pCDH,差异具有统计学意义(p<0.01)。第四部分miR-34a在hPDLCs成骨分化过程中的作用以矿化诱导液诱导hPDLCs成骨分化,在3、7、14天后检测miR-34a基因的表达变化。然后,构建hPDLCs/34a及hPDLCs/pCDH细胞并诱导成骨分化3、7、14和21天。分析成骨标志基因碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、Runt 相关转录因子 2(Runt-related transcription factor2,Runx2)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)及骨涎蛋白(Bone sialoprotein,BSP)的表达变化,ALP活性、ALP染色以及钙化结节形成的茜素红染色情况。结果:1)miR-34a的表达量在第3天开始显著上调,并呈逐渐增高趋势,差异具有统计学意义(P<0.001)。2)qRT-PCR结果显示:ALP和Runx2作为成骨早期标志基因,在矿化诱导早期,随着矿化时间的延长,表达量基本上呈逐渐增高趋势。与hPDLCs/pCDH相比,hPDLCs/34a组的基因表达量略有增高(p<0.05);而在矿化诱导中晚期,BSP的表达量在14天时达到最高,hPDLCs/34a组表达量较hPDLCs/pCDH组显著降低(p<0.001),矿化诱导21天时则相反(p<0.01);OCN的表达量在14天时两组无明显差异,在诱导21天时,hPDLCs/34a组较hPDLCs/pCDH组降低(p<0.01)。3)与hPDLCs/pCDH组相比,hPDLCs/34a组的ALP活性、ALP染色和矿化结节的茜素红染色均有明显减弱。结论:本实验发现:miR-34a在正常牙周组织中呈阳性表达,且在人牙周炎患牙的牙周膜组织中表达上调,同时miR-34a靶基因Notch1和SIRT1的表达下调;在体外hPDLCs细胞培养条件下,LPS刺激后miR-34a表达上调,Notch1表达下降,过表达miR-34a后可显著增强IL-6、IL-1β及TNF-α等炎性因子的表达。此外,miR-34a在hPDLCs成骨分化过程中表达增高,过表达miR-34a可以抑制hPDLCs的增殖能力、碱性磷酸酶表达和矿化结节的形成。本研究的结果提示:miR-34a可以增强牙周组织炎症相关因子的表达,同时抑制牙周膜细胞的增殖和成骨向分化,这一作用可能通过miR-34a下调Notch1的表达实现。miR-34a在牙周组织炎症过程中,可能发挥促进炎症、抑制组织再生的作用。根据这些研究我们推测抑制miR-34a可能会有利于牙周组织炎症的转轨,miR-34a可能是牙周炎治疗的一个潜在靶点。