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本文分两部分论述了白腰文鸟前脑cDNA文库构建及雌雄白腰文鸟前脑基因差异表达筛选。
第一部分:利用白腰文鸟前脑为材料,提取总RNA;用LD-PCR法反转录合成双链cDNA;经蛋白酶K消化、Sfi I酶切、CHROMASPIN-400柱分离除去小于500bp的片段;将cDNA与载体λTripl EX2按一定比例连接;经体外包装,建立白腰文鸟前脑cDNA的噬菌体文库。对文库的各项指标进行检测表明,原始文库的滴度为2.8×10<5> pfu/ml,文库重组率为91.4%。结果表明该文库为高效、全长的cDNA文库,可以用于特异表达基因的筛选。
在鸣禽发声核团发育过程中,伴随着大量的细胞凋亡。一般认为细胞凋亡是雌雄鸟发声控制系统出现性双态的原因之一。Bax基因是Bcl-2家族的重要成员,是调控细胞凋亡的一个因子。研究表明,在白腰文鸟脑发育的各个时期,Bax均有不同程度的表达。对Bax在文库中进行筛选,可以更好地了解凋亡基因在发声核团发育不同时期的表达情况,并获取其在白腰文鸟中的全长序列。实验使用PCR的方法,以白腰文鸟中Bax基因片断为模板构建同位素探针,将噬菌体铺板,转移至NC膜上,进行Bax基因的筛选。
第二部分:使用抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)的方法筛选在幼年期白腰文鸟的前脑中,雌雄之间差异表达的基因。SSH筛选构建了只在雄性白腰文鸟幼鸟脑中特异性表达基因的cDNA文库,从中挑选了199个阳性克隆进行点膜杂交,共有67个克隆表现出雌雄差异,全部测序比对后发现33个克隆与已知基因呈现同源性。其包括类型广泛,既有细胞内信号传导相关基因,也有同基因转录、蛋白折叠和运输等过程相关的基因。对其中的两个基因:髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein)和小清蛋白(parvalbumin)进行原位杂交实验,观测其在幼年期(5天、15天)和成年期的表达量、分布位置及雌雄差异的情况。结果显示:髓鞘碱性蛋白的大量表达和雌雄差异的形成,发生在出生后晚期至成年期,当HVC和RA均已发育成熟、神经投射已经建立之时。这可能是由于髓鞘碱性蛋白主要负责神经纤维的髓鞘化,而髓鞘化可看作是神经细胞、核团以及各核团间的联系最终成熟的标志。小清蛋白在幼年期很早即有标记,并逐渐显现出雌雄差异。在成鸟中则更为明显:雄鸟各鸣唱核团广泛表达这一蛋白,同时雌鸟中只有微弱标记或无标记。这说明小清蛋白很可能同鸣唱行为的发育具有密切联系。