结肠癌（Colorectal cancer）是最常见的消化道肿瘤之一,发病率位于癌症的第三位,严重威胁到人们的生命健康。目前,结肠癌的治疗仍然以手术切除治疗联合放化疗为主,但是术后容易复发和转移,治疗效果均不理想。因此,寻找有效治疗结肠癌的方案愈显关键。近年来,研究者发现肿瘤中有为数不多的,且具有自我更新和分化能力干细胞特性的肿瘤干细胞（Cancer stem cell,CSC）,被认为是肿瘤生长,转移和复发的根源。肿瘤干细胞理论的提出为结肠癌的根治带来了希望。研究发现,LY6/uPAR超家族（Ly-6/urokinase-type plasminogen activator receptor（uPAR）superfamily）成员LY6E影响肿瘤的发生发展,促进免疫逃逸,与多种肿瘤不良预后密切相关;LY6H不仅在中枢神经系统和免疫系统中发挥作用,还与肿瘤患者的生存期差相关;LY6K多肽疫苗已经进入II期临床试验,在治疗肺癌、食管癌和胃癌等肿瘤中效果颇佳,具有较好的肿瘤治疗的前景;PSCA影响肿瘤的生长、迁移和转移。因此,它们可能是肿瘤治疗的潜在靶点。有研究表明LY6E、LY6H、LY6K和PSCA在结肠癌中也过表达,但是它们在结肠癌干细胞（Colorectal cancer stem cell,CCSC）中的表达水平尚不清楚。随后,我们通过Real-time PCR检测了LY6E、LY6H、LY6K和PSCA在结肠癌干细胞中的表达,发现EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞中LY6K和PSCA mRNA表达显著高于HCT-116细胞（P<0.001）,LY6E mRNA表达显著低于HCT-116细胞（P<0.05）,LY6H mRNA表达与HCT-116细胞相比无显著性差异。因此,为了探究LY6K基因对人结肠癌干细胞的生物学影响,本文进行以下实验:首先通过免疫磁珠法,以EpCAM和CD44为肿瘤干细胞筛选标志,从人结肠癌细胞系HCT-116中筛选出EpCAM⁺CD44⁺HCT-116的人结肠癌干细胞。然后利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）沉默人结肠癌干细胞中LY6K基因的表达,探究其对人结肠癌干细胞的增殖、细胞周期、侵袭和凋亡等生物学行为的影响。结果显示,筛选获得的EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞可以在无血清培养基中悬浮生长,由单个细胞逐渐生长成肿瘤微球;经含血清培养基诱导后,EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞转为贴壁生长;Real-time PCR结果显示,EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞中干性基因Nanog、OCT-4、SOX-2和c-myc mRNA表达显著高于HCT-116细胞（P<0.01）。EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞经LY6K siRNA作用48h之后,细胞中LY6K基因的mRNA和蛋白表达水平均显著下降（P<0.001）。MTS结果显示,LY6K基因沉默可显著抑制EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞的增殖（P<0.01）。细胞周期实验显示,LY6K基因沉默能够导致EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞发生G₁期阻滞;同时Western Blot结果显示,EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞中CDK4和CDK2蛋白表达量显著降低（P<0.01,P<0.05）,细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E1表达量与Blank组和NC组无显著性差异。Transwell小室结果显示,沉默LY6K基因可显著抑制EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞的迁移和侵袭（P<0.05,P<0.001）;同时Western Blot结果显示,EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞中MMP2和MMP9蛋白表达量显著降低（P<0.05）,而TIMP1蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。Annexin V-FITC/PI双染法检测早期和晚期凋亡细胞结果显示,EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞的LY6K基因沉默后,早期和晚期凋亡细胞的百分率与Blank组和NC组无差异;Western Blot结果显示,EpCAM⁺CD44⁺HCT-116中caspase-3和cleaved caspase-3蛋白表达量与Blank组和NC组无显著性差异。综上所述,LY6K和PSCA在EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞中高表达;siLY6K能够抑制EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞发生G₁期阻滞,但对EpCAM⁺CD44⁺HCT-116细胞凋亡无影响,这为靶向结肠癌干细胞治疗提供了实验依据。