利用转基因技术调控水稻花青素代谢途径

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花青素(anthocyanin)是植物重要的次级代谢产物之一,主要以糖苷的形式存在于植物细胞中,赋予植物缤纷的色彩,是迄今为止所发现的最强效的自由基清除剂。在植物发育过程中,花青素类物质具有使植物免受紫外辐射、抗病原菌侵染等重要的生理作用;同时,花青素具有很好的营养价值和保健功能,如提高视觉灵敏性、抑制脂质过氧化、防止血小板聚集、维持血管正常的通透性、抗肿瘤、抗突变和抗辐射等。经过长期的人工驯化,现在的主栽水稻品种以白米为主;在种植的色稻中,花青素大都积累在籽粒的种皮部。由于花青素的物理水溶性,在食用过程中很容易造成营养成份的流失。本论文通过分子生物学手段将金鱼草中调节花青素合成的转录因子Delila和Rosea基因导入水稻基因组中,希望通过外源基因调控水稻胚乳中花青素的代谢合成,尝试改变水稻籽粒中花青素的积累。本研究主要包括以下几方面内容:1)通过基因工程方法将金鱼草中调节花青素合成的转录因子Delila和Rosea分别构建了过量表达载体pROK2-Delila,pCAMBIA1300-Rosea,pCAMBIA1300-Rosea-Delila。通过农杆菌介导法分别侵染水稻的愈伤组织,经过共培养、抗性筛选、预分化、再分化、生根培养等分别获得20株,25株和40株转基因植株,经分子鉴定表明:其中60株为转基因植株。2)通过RT-PCR分析和Northern Blot杂交表明外源基因已在水稻植株中稳定表达;利用半定量RT-PCR的方法选取外源基因表达量较高的转基因株系并分析了花青素合成途径中关键的结构基因CHS、F3H、DFR、ANS、UFGT,在开花不同时期的表达水平。结果表明:转基因株系中DFR的表达水平较野生型对照有不同程度的提高;由于转基因个体间的差异,不同株系间结构基因也存在表达差异。3)测定了转基因植株叶片中花青素的相对总含量。结果表明转基因植株R21-3和RD33-5叶片中花青素总含量较野生型分别提高了8.85%和11.4%,而D17-8比野生型降低了16.2%;利用HPLC方法分析了转基因水稻籽粒中花青素和类黄酮的成份及含量,结果表明,与野生型相比,转基因植株中花青素和类黄酮的成分及含量没有明显变化。4)分别克隆了黑米和野生型植株中的DFR,序列对比发现:野生型水稻的DFR的序列在第二个外显子中密码子TCG突变成了终止密码TAG,导致转录提前终止。鉴于DFR在花青素合成途径中的重要地位,本实验构建了DFR的过量表达载体。5)克隆了水稻的GluC启动子,为将来DFR基因在胚乳中的特异性表达做准备。
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