疟疾是疟原虫通过蚊传播的人类最严重的寄生原虫感染性疾病。全球每年罹患疟疾的人数超过5亿，约200万人因其死亡，目前世界至少有22亿人口面临疟疾的威胁。WHO已于2003年将艾滋病、结核和疟疾列为全球三大优先重点防治的感染性疾病。 疟疾发病的本质特征是疟原虫红内期裂殖体的裂体增殖过程。在此过程中，疟原虫为了抵抗宿主的免疫应答，在其生长/寄生周期中表达相关的阶段特异性和种特异性抗原蛋白，并且在宿主免疫压力下呈现普遍的多态性。在恶性疟原虫感染红细胞表面已发现由原虫分泌产生的黏附物质，黏附在脑组织的末梢血管内壁，引发脑疟并导致死亡。恶性疟原虫感染的红细胞不仅黏附于血管内皮，而且也黏附在未感染的正常红细胞表面(玫瑰花结形成)提高致病性。另一方面，间日疟原虫也可形成相似的玫瑰花结构，但至今尚未明确发现在间日疟原虫基因组中有其相似分子。 Gerhard Winter等曾于2005年报道过在恶性疟原虫感染红细胞表面表达一种SURFIN的多态性抗原，编码的surf基因在不同的机体免疫压力下，进行着高效的克隆变异，从而在感染的红细胞表面表达具有多态性的SURFIN蛋白抗原，以便使其有效的逃避宿主机体针对于SURFIN蛋白抗原的免疫监视。delPortillo等在间日疟的亚端粒区域发现一种跨膜蛋白PvSTP1，其结构与间日疟PvVIR蛋白具有较大的差异，应用进化分析方法得出恶性疟SURFIN与间日疟PvSTP1同属一个分化单位SuRFIN-PvSTP1进化分支，即在结构和序列上具有相似性，是至今为止发现的间日疟感染红细胞表面唯一与恶性SURFIN具有相似结构的蛋白抗原，由此提示二者在疟原虫的致病过程中应具有相似的功能。 本文预探讨我国间日疟分离株Pvstpl基因胞外段的特点，与标准株IVD-10相比，预测其突变程度，确定其决定选择压力的免疫靶位，以期为阐明间日疟原虫发病机制、宿主与病原体之间的相互关系提供新的理论依据。 材料与方法： 在我国疟疾流行季节，从疟疾高发的混合流行区云南省，中低密度单一流行区浙江省、湖北省采集患者指尖血样本，涂制患者厚/薄血涂片，镜检疟原虫红细胞感染情况。另取指尖血滴于无菌滤纸片上，自然干燥后，置于常温干燥环境下保存待检。 应用QIAampDNAminikit试剂盒提取间日疟原虫gDNA，采用KOD-Plus高保真聚合酶扩增目的基因Pvstpl胞外段，对PCR产物进行电泳、纯化与回收。应用TAKARADNAA-Tailingkit，在己纯化的PCR产物3末端添加A尾，构建Pvstpl-pMD19-T重组DNA质粒载体，将其克隆入感受态细胞JM109中，提取质粒DNA后测序。 实验结果： 1、本实验成功扩增Pvstpl基因胞外段，该基因序列全长1245bp，G+C含量比例为30.52％。该基因共编码414个的氨基酸。 2、我国间日疟分离株与IVD-10株比较，碱基水平上共有183处发生置换，占14.70％(183/1245)，导致126个氨基酸位点发生改变，占30.43％(126/414)； 3、以我国湖北分离株A1为标准对我国间日疟分离株进行比较，除云南分离株Y5外只有10处发生碱基置换，占0.80％(10/1245)，导致6处氨基酸位点发生置换，占1.45％(6/414)。 4、该基因在碱基水平上很少出现插入和缺失，只在我国分离株Y5的652-654位点上有3个连续的A插入，导致氨基酸水平218位点处有一个赖氨酸的插入。 5、间日疟IVD-10株的PvSTP1蛋白胞外段共有5个半胱氨酸位点分别为49-100-122-143-194，我国间日疟分离株与IVD-10比较在碱基545位点处发生突变(A→G)，导致氨基酸水平上182位点处发生置换(Y→C)，导致我国间日疟分离株PvSTP1蛋白胞外段共有6处半胱氨酸位点分别为49-100-122-143-182-194。 讨论： 间日疟原虫编码相关抗原基因的研究仅始于近年，delPortillo等利用自然感染疟疾患者体内的间日疟原虫构建了一个YAC文库。该文库包含一些端粒YAC克隆，挑选其中的一个克隆IVD-10用于进一步研究，发现一个特殊的基因，编码间日疟原虫亚端粒跨膜蛋白1的Pvstpl基因，表达PVSTP1蛋白抗原。 经分析，Pvstpl基因位于间日疟染色体亚端粒区域，胞外段序列全长1245bp，共编码414个的氨基酸。本研究结果显示，该基因在碱基水平上很少出现插入和缺失。同源性比较，我国分离株与IVD-10株同源性为86％-90％，我国云南株、湖北株、浙江株之间差异较小，同源性较高，达到95％-99％。 Pvstpl基因在间日疟红内期表达，其表达的蛋白通过细胞浆定位于感染的红细胞表面。PvSTP1蛋白结构具有一个跨膜区域，不含N-端信号肽，胞外区含有N-端半胱氨酸富含区(CRDs)，胞内段C-端具有特征性的保守色氨酸富含区(WRDs)，与间日疟vir和约氏疟yir同源均为疟原虫pir基因家族。PvSTP1蛋白与许多疟原虫株的表面输出蛋白(SURFIN，PvVIR，PfEMP1，PkSICAvar，Pf332等)在结构和序列上具有相似性。 应用进化分析方法得出恶性疟SURFIN与间日疟PvSTP1同属一个分化单位SURFIN-PvSTP1进化分支，二者在胞外区N-端都具有WRD区，在结构上与输出分子的胞外段(Pf332)和表面表达分子(PvVIR、PfEMP1andPkSICAvar)相似，不同之处在于二者在WRD区与TM区间具有较长的氨基酸突变区域；二者在胞内区C-端具有特征性的中度保守WRD区，在结构上与输出蛋白(PfEMP1)具有类似结构。据研究，编码SURFIN的mRNA存在于红内期所有发育阶段，但在宿主免疫压力下其表达定位于不同的毒力效应细胞器，针对SURFIN的特异性抗体能够识别恶性疟原虫成熟发育阶段并与之反应；SURFIN为感染红细胞和游离裂殖子表面表达的主要标记蛋白，在裂殖子的顶突形成非结晶的新月形结构，是连接裂殖子和感染红细胞间具有黏附作用的关键分子，可以黏附在未感染的正常红细胞表面形成与致病性相关的玫瑰花样结构，它为裂殖子和感染红细胞在第一时间建立了抗原性连接。 间日疟原虫PvSTP1与恶性疟原虫SURFIN属于进化过程中的同源蛋白，其结构相似，故该蛋白应具有输出蛋白和表面蛋白的属性与特征；Pvstpl基因和surf基因家族均位于染色体的亚端粒区域，两者的编码产物PvSTP1和SURFIN在胞外区具有极其相似的富含半胱氨酸的局部保守序列，因此可能是裂殖子和感染红细胞之间识别、黏附的关键分子；从我国间日疟原虫分离株测序比对结果显示，在氨基酸水平上182位点处发生置换(Y→C)，使得我国间日疟分离株PvSTP1蛋白共有6处半胱氨酸位点，进一步提示我国分离株的PvSTP1蛋白与识别、黏附等的相关性较高；从而提示PvSTP1蛋白与间日疟原虫侵入人体后致病过程中形成类似于恶性疟的玫瑰花结构有关。 PvVIR是间日疟原虫标志性蛋白抗原，具有免疫原性和抗原变异性，在间日疟红内期与脾特异性细胞粘连和免疫逃避中起着重要的作用。与PvSTP1蛋白比较，可以看出二者在蛋白的一级结构上具有较大的差异：PvSTP1胞外区域N-端的CRD区之后有一个可变异片段，该片段在VIR中缺如；Pvstpl具有多处的基因突变位点，其表达的蛋白抗原在CRDs区与TM区之间具有一定的多态性，使其在面临宿主免疫压力时在相应的碱基位点发生突变，导致其表达多态性蛋白抗原，从而逃避机体的免疫监视，造成虫体再次大量的繁殖，提示与间日疟慢性持续性感染具有一定的联系。通过本研究得到的在碱基水平上的差异可以提示，PvSTP1在间日疟侵入人体致病过程中可能发挥着不同于PvVIR蛋白的功能，从而进一步为疟原虫抗原变异奠定理论基础。 实验结果显示，我国云南、湖北、浙江等地间日疟分离株之间比对后可以看出，中国株之间相对保守，提示我国上述三个间日疟流行区人群在其感染过程中具有不同于IVD-10流行区人群的免疫压力。 综上所述，我们推测间日疟原虫Pvstpl与vir基因具有不同的功能，其表达的PvSTP1蛋白与恶性疟原虫SURFIN蛋白具有较多相似之处，提示PvSTP1蛋白是间日疟原虫毒力因子之一，具有输出蛋白和表面蛋白的属性与特征，黏附与免疫逃逸的相关可能性很高，与间日疟原虫侵入人体后形成的与致病性相关的玫瑰花结构有关，可以为间日疟原虫的致病机制研究提供新的理论和实验依据。 结论： 1、首次成功扩增间日疟原虫Pvstpl基因胞外段。 2、间日疟原虫Pvstpl基因胞外段全长1245bp，G+C含量比例为30.52％，共编码414个的氨基酸。 3、Pvstpl基因胞外段存在多处突变位点，表达PvSTP1多态性蛋白抗原，推测为间日疟原虫毒力因子之一。