论文部分内容阅读
第一部分家族性高胆固醇血症家系研究以及中国纯合家族性高胆固醇血症诊治现状分析目的:本研究综合分析一例LDLR基因复合杂合突变的Ho FH家系,进一步收集资料分析中国Ho FH临床特点以及基因检测情况,以提高对中国Ho FH的诊疗现状认识,强调基因诊断在Ho FH诊疗中的作用并提出诊疗意见。方法:以1例Ho FH患儿先证者及其家系为研究对象,回顾性总结分析其临床资料(年龄、发病时间、血脂全套等生化检查、影像学检查、家族史、治疗方案、随访3年血脂谱变化情况)。进一步采用二代靶向测序技术检测高脂血症相关基因(LDLR,APOB,PCSK9,ABCG5,ABCG8,ANGPTL3,APOC3,LDLRAP1),并进一步采用短串联重复序列分析法(Short tandem repeats,STR)及单核苷酸多态性位点(Single nucleotide polymorphism,SNP)分析确定先证者与父母亲本关系。并综合搜索国内外数据库收录的中国Ho FH家系报道,做中国Ho FH疾病特点及诊疗现状分析。结果:共调查3代5人,共有3人可诊断为FH,其中先证者临床诊断为Ho FH,母亲临床诊断为杂合型家族性高胆固醇血症(Heterozygous Familial hypercholesterolemia,He FH),外祖父临床诊断也为He FH。基因检测结果提示先证者带有LDLR复合杂合突变(c.724C>T;p.Gln242*及c.1747C>T;p.His583Tyr),患儿母亲为LDLR杂合突变(c.1747C>T;p.His583Tyr),患儿父亲无LDLR基因突变。其父母非近亲婚配,且家系验证排除了非亲本关系,证实先证者c.724C>T;p.Gln242*为极罕见的自发突变,源于父源链。患儿在经过阿托伐他汀单药治疗1年余后低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)从14.87mmol/L下降至9 mmol/L左右(~40%),总胆固醇(Total cholesterol,TC)从20.31mmol/L下降至12 mmol/L左右(~40%),无进一步下降。依折麦布联合辛伐他汀两药联合治疗后患儿LDL-C进一步下降至6 mmol/L(~60%),TC水平进一步下降至9 mmol/L左右(~56%)。中国已报道Ho FH病例116例,诊断率仅约占总预估患病人数(约1400人)8.29%,其中仅有74人行基因诊断确诊(5.29%)。结论:本研究通过分析罕见的LDLR复合杂合突变导致的Ho FH家系以及中国Ho FH诊疗现状,基于我们病例的诊疗过程提倡“早期基因诊断指导临床治疗”的诊疗模式以及强调早期联合治疗在儿童Ho FH中的重要性。此外,虽然Ho FH患病率低,但中国有380万潜在的He FH患者,因此应尽早在儿童中开展疾病筛查。第二部分促甲状腺激素调控PCSK9参与胆固醇代谢的机制研究目的:TSH与脂代谢异常密切相关,PCSK9可降解肝脏LDLR,在调节胆固醇代谢中发挥重要作用。本研究拟讨论TSH在胆固醇代谢中的作用及调控PCSK9的相关机制。方法:本部分分为体外研究及在体动物实验。体外细胞实验以Hep G2细胞系为载体,使用重组人TSH(recombiment human TSH,rh TSH)处理细胞后采用Western Blot、Realtime PCR、流式细胞术、小干扰RNA(Small interfering RNA,Si RNA)等方法探究TSH调控PCSK9表达的信号通路及对LDLR表达的影响。进一步通过甲状腺切除手术建立甲减模型,进行外源性甲状腺激素(L-Thyroxine,L-T4)及TSH处理构建亚临床甲减大鼠模型,观察甲状腺激素缺如及再补充以及外源性促甲状腺素(bovine TSH,b TSH)处理对大鼠循环中总胆固醇及PCSK9水平的影响,TSH处理后观察肝脏固醇调节元件结合蛋白-1C(Sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP1C)、固醇调节元件结合蛋白2(Sterol regulatory element binding protein-2,SREBP2)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(Hydroxy-3-methyl-glutaryl-Co A Reductase,HMGCR)等胆固醇代谢相关指标基因表达,同时通过免疫组化观察肝脏LDLR蛋白水平的变化。结果:1.细胞实验证明rh TSH刺激后Hep G2细胞LDLR基因表达增加,但细胞膜表面LDLR水平明显降低;rh TSH刺激后Hep G2肝细胞系PCSK9基因及蛋白水平均升高,可能和SREBP1C、SREBP2、HMGCR这些关键转录因子有关,其中SREBP1C、SREBP2可能参与TSH上调PCSK9表达的信号通路关键因子。2.甲减大鼠模型的建立:通过手术切除大鼠甲状腺,四周后甲减模型建立成功。甲减组大鼠血清甲状腺素(Tetraiodothyronine,TT4)明显低于假手术组,TSH明显高于正常对照组,体重增长明显慢于正常对照组,血清TC含量高于正常对照组,PCSK9水平高于对照组,差异有统计学意义。3.亚甲减大鼠模型的建立:使用L-T4处理甲减组大鼠,L-T4处理组体重增长快于PBS处理甲减组,血清TC及PCSK9水平低于PBS处理甲减组。进一步构建亚甲减大鼠模型,发现亚甲减大鼠血清PCSK9及TC水平高于对照组,肝脏PCSK9及SREBP1C、SREBP2、HMGCR基因表达高于对照组,而LDLR蛋白水平低于对照组。结论:本研究通过体内外实验证明TSH通过上调肝脏PCSK9表达影响LDLR降解减少肝脏对LDL-C的摄取清除,从而参与机体胆固醇代谢,使用大鼠模型模拟了临床甲状腺机能减退以及亚临床甲状腺机能减退脂代谢异常状态,有助于理解甲状腺功能紊乱疾病的脂代谢异常病理机制,对指导临床治疗有重要的应用价值。