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目前海南番木瓜病毒病防治对象主要为木瓜环斑病毒(PRSV),但近年来研究发现木瓜畸形花叶病毒(PLDMV),既能感染非转基因番木瓜,也能感染抗PRSV的转基因番木瓜,而且极大加速 papaya leaf distortion mosaic virus 的传播,因此 papaya leaf distortion mosaic virus是番木瓜生产的新威胁,与PRSV(常见的木瓜环斑病毒)一样都是具有毁灭性的。因此研究PLDMV致病机制及其防治方法意义重大。构建含有荧光标记的PLDMV侵染性克隆是研究PLDMV致病机制及其防治策略的重要工具。本研究在克隆获得PLDMV-DF(海南东方毒源)全长cDNA基础上,利用Gibson组装融合克隆法成功构建由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动的与农杆菌感染相容的pPLDMV病毒表达载体,以及绿色荧光和红色荧光蛋白标记的pPLDMV-GFP、pPLDMV-mCherry病毒表达载体。将这些载体直接转化到根癌农杆菌C58C1中构建成农杆菌工程菌株,通过注射接种番木瓜植株,接种30天时发现有95%的番木瓜幼苗感染了 PLDMV-GFP或PLDMV-mCherry,表现出典型的如野生型PLDMV引起的系统性症状;在荧光显微镜和紫外光照灯下观察,发现受侵染的番木瓜植株叶片、茎和根中可见绿色和红色荧光。经过RT-PCR监测分析,表明PLDMV、PLDMV-GFP和PLDMV-mCherry在番木瓜植株中稳定了 90天以上,并连续传代至第六代以上(30天/代);同时Western blot分析结果表明GFP、mCherry荧光蛋白在被感染的番木瓜植株中获得了表达。以上这些侵染性克隆尤其是含荧光的侵染性克隆的构建将有助于研究PLDMV致病机制、病毒与宿主互作和病毒运动等方面,还可构建弱毒株系用于番木瓜抗PLDMV的研究。这是一种新的克隆策略,基于Gibson组装融合克隆法和直接的根杆癌转化,与传统方法相比,这种构建植物病毒全长侵染性cDNA克隆方法具有简单、高效、快速等优点。本研究通过前人实验的基础之上构建(PLDMV-DF)cDNA全长侵染性克隆及其插入外源(GFP、mCherry)报告基因的病毒表达载体,所设立的这些实验不仅为研究番木瓜畸形花叶病毒PLDMV的病理、分子机制、防治PLDMV新策略等方面奠定理论基础和实验依据,而且亦为多种其它病毒属(马铃薯Y病毒)的侵染性克隆构建方法及相关应用提供了新的借鉴和参考。