酸性电解水清除食源性致病菌生物被膜的初步机理研究

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在食品加工过程中,食源性致病菌极易黏附在食品或加工器械表面,会分泌出大量的胞外聚集物(ExtracellularPolymericSubstances,EPS),并且这些聚集物会把细菌包裹起来而形成高度有组织的,复杂的三维膜状结构,即生物被膜(Biofilm,BF)。由于生物被膜的形成,BF菌被EPS包裹起来,使得其相对于浮游菌来说,对常用的消毒剂、抗生素等产生很强的抗性。然而,现在常用的消毒剂并没有完全破坏BF的三维结构以达到彻底清除的目的,造成二次污染严重危害人类健康。故本文,选用一种新型、安全、高效的杀菌剂—酸性电解水(Acidicelectrolyzedwater,AEW),来探究酸性电解水对食源性致病菌生物被膜的清除作用及其初步机制。本研究对致病菌引起的食品安全问题以及为未来的防控措施有非常重要的意义。  本文主要是以大肠杆菌K12、副溶血性弧菌S36和单增李斯特菌WaX12为研究对象,首先,探究了不同NaCl浓度制得的酸性电解水在处理不同的时间后,清除生物被膜的最优方法;其次,酸性电解水对生物被膜结构特性及其参数的影响进行了研究;然后,利用化学方法、拉曼光谱和激光共聚焦显微镜来探究酸性电解水对胞外聚合物EPS的作用效果。最后,应用RT-qPCR的方法探究了酸性电解水对QS、鞭毛、EPS和毒力相关基因的表达情况。本文的研究为清除食源性致病菌BF提供一个新的方法,其清除机理也为后续控制BF的研究提供了理论基础。本文主要研究内容及研究结果如下:  1.酸性电解水对食源性致病菌生物被膜菌的作用效果研究  本研究运用结晶紫染色法和MTT法测定了大肠杆菌BF形成过程中生物总量和细胞代谢活性的变化;用荧光显微镜直接地,无损地观察了大肠杆菌BF形态结构的变化过程。结果发现,培养24h的大肠杆菌BF已经达到稳定成熟的结构。然后在已经形成成熟的生物被膜后,选用不同NaCl浓度(0.01%,0.1%,0.3%,0.5%)的酸性电解水和不同处理时间(2min,5min,10min)来清除大肠杆菌、副溶血性弧菌和单增李斯特菌BF。结果发现,AEW-3(0.3%)处理5min是酸性电解水最优处理条件,清除率达到82%,细胞代谢活性也降低到原来的11.35%。此外,酸性电解水处理食源性致病菌BF后,处理后的残液内的活菌数低于检测值,不会给环境造成二次污染。  2.酸性电解水对食源性致病菌生物被膜结构特性的影响  本文应用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜结合ISA软件分析和扫描电镜的方法观察分析了酸性电解水对生物被膜结构特性的影响。结果表明,大肠杆菌生物被膜的绿色荧光及分布密度明显减少,荧光强度也有显著的降低;CLSM观察并且通过ISA软件分析显示AEW处理BF后,导致BF结构崩解,分布稀疏散落。其结构多孔性,粗糙度增加,而生物量和平均厚度显著降低;应用SEM观察BF结构形态发生明显的变化,部分细胞发生裂解。  3.酸性电解水对胞外聚合物EPS的作用  本研究利用化学方法分析了酸性电解水处理生物被膜后,胞外多糖和胞外蛋白含量的变化,并用拉曼光谱对AEW的作用位点进行测定,最后用CLSM观察验证酸性电解水对胞外多聚物的破坏作用,探究了AEW清除BF的初步机理。结果表明,AEW对胞外多糖和胞外蛋白均有显著地效果,并且对单增李斯特菌中胞外蛋白的效果更显著,降低了75%。利用拉曼光谱揭示了酸性电解水对EPS关键作用位点:多糖的C-O-C键、酪氨酸及苯丙氨酸的芳香环。用CLSM观察酸性电解水对胞外多糖的破坏作用,发现酸性电解水处理后胞外多糖分布明显稀薄。  4.酸性电解水对生物被膜相关基因表达水平的影响  本研究通过RT-qPCR方法分析生物被膜相关基因(鞭毛、QS、毒力、EPS)的表达水平来进一步研究酸性电解水清除生物被膜的相关机制。结果表明酸性电解水处理生物被膜后,QS和鞭毛相关基因显著地下调,酸性电解水会影响细菌之间的信号交流。酸性电解水处理生物被膜后,EPS相关基因也有显著地下调,这也验证了之前酸性电解水对EPS的破坏作用。酸性电解水处理生物被膜后,副溶血性弧菌T3SS1相关基因有显著地调节作用,且单增李斯特菌毒力基因也有显著地差异,酸性电解水也会通过影响毒力基因的表达从而使得生物被膜发生变化。
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