随着人民生活水平的提高,膳食结构和生活方式的改变导致了与糖脂代谢紊乱相关疾病的迅猛增加,糖尿病及其并发症等已成为一个全球性的健康威胁。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是指发生于糖尿病患者的一种以心肌结构和功能异常为主的特异性心肌病,它独立于冠心病、高血压、心脏瓣膜病等心脏病变,是导致糖尿病患者最终死亡的主要原因之一。DCM的确切发病机制还不清楚,它涉及多种因素的共同参与,包括高血糖、高胰岛素血症、异常脂肪酸代谢、氧化应激、心脏自主神经病变和局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统的过度激活等。而高血糖通常被认为是激活和异常调节几条代谢途径启动糖尿病心肌损害的关键。糖尿病中高血糖,可引起心肌代谢异常,使葡萄糖自氧化,游离脂肪酸和瘦素等因素升高,造成活性氧(Reactive oxygen species,ROS)增多,发生氧化应激,最终导致心肌细胞的自噬与凋亡。自噬过程中形成的自噬溶酶体,可以将细胞内受损的细胞器、变形的蛋白质和病原体等进行降解,进而维持细胞内的稳态。研究发现,一定程度的自噬可降低心肌细胞内的游离脂肪酸的水平,改善糖尿病心肌脂代谢紊乱、维持心肌细胞内环境稳态平衡。同时,自噬与ROS之间存在此消彼长的关系,ROS可诱导自噬产生,而自噬也可调控ROS水平。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的程序性死亡,也可以维持内环境稳定。有研究证实,心肌细胞凋亡在糖尿病心肌病病程发展中是导致心功能不全的重要原因。Keap1/Nrf2信号通路是调控细胞内氧化应激反应的重要途径,通过调节抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶等产生抗氧化作用,是细胞抵抗外来物质、抑制肿瘤生成等的重要防御保护机制。蛋白磷酸酶2A(Proteinphosphatase,PP2A)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,通过使已磷酸化激活的蛋白质可逆性脱磷酸,在信号传导中承担负性调节的作用。研究显示,PP2A在代谢中会参与胰岛素的激活,有改善胰岛素抵抗的作用。也有实验结果表明,提高PP2A活性可以改善高糖诱导的心肌细胞凋亡;抑制PP2A的活性将导致IKKα/IKKβ持续磷酸化,不能终止NF-κB信号通路激活等。但在高糖环境下,PP2A/Nrf2对心肌细胞如何通过自噬及凋亡进行调节,还不清楚。本课题主要通过体内、外实验,对PP2A/Nrf2在实验性糖尿病心肌病中的作用进行了研究,并对其作用机制进行探讨,为开发预防及治疗糖尿病心肌病的药物奠定基础。对于自噬及凋亡通路的研究,将有利于探讨糖尿病心肌病的发生发展过程及机制,为研发新的预防或治疗糖尿病性心肌病、继而心衰以及心肌梗死等心脏疾病的药物寻找靶点。体外实验:MTT结果显示,随着浓度和时间的增长,葡萄糖对心肌细胞活力有明显的抑制作用;采用高糖培养心肌细胞后拍照,并用Image Pro Plus软件统计各组细胞表面积,结果显示50mmol/L的葡萄糖培养72h能够诱导心肌表面积的增加;以上结果提示,高糖能够诱导实验性心肌病变。采用AO染色、LTG染色以及Western blotting考察了高糖对心肌自噬水平的影响,并用自噬抑制剂3-MA作为对照。结果显示3-MA预处理可抑制高糖诱导自噬水平的升高;采用ROS的抑制剂NAC作对照,DCFH-DA荧光探针染色检测心肌细胞内ROS水平,结果显示高糖组ROS水平显著升高;采用AO染色和LTG染色发现,NAC可抑制高糖组自噬水平的升高;Western blotting结果显示:高糖组能够增加HIF-lα的表达和Nrf2的入核,升高自噬相关LC3B2/LC3B1的比值,降低P62的表达,下调PI3K/Akt/mTOR和上调ERK的蛋白表达。以上结果显示:高糖通过刺激ROS产生增多,调控PI3K/Akt/mTOR和ERK信号通路,从而激活自噬。为了研究PP2A对高糖诱导的心肌病的作用和机制,采用PP2A的抑制剂(OA)和激动剂(FTY720)以及高/低表达PP2A腺病毒。AO染色和LTG染色发现,高表达和低表达PP2A组均可使高糖引起的自噬水平降低;Western blotting结果显示,低表达PP2A+NAC组、高表达PP2A组均能够降低Nrf2蛋白的表达水平,同时降低自噬相关蛋白LC3B2/LC3B1的比值,升高P62的表达。结果表明:PP2A可能是通过抑制ROS的产生影响高糖诱导的细胞自噬;Hoechst 33342染色和Annexin V/PI双染凋亡检测发现,高糖组凋亡水平变化不明显,抑制ROS后,凋亡水平升高。低表达PP2A组凋亡抑制,而与NAC合用时,凋亡水平明显升高。高表达PP2A组与OA组结果相反,单独使PP2A表达水平升高时,Bcl-2的表达被抑制,凋亡水平明显升高,而与NAC合用后,凋亡被抑制。结果表明:PP2A可能是通过抑制ROS的产生影响心肌凋亡。同时,结果发现PP2A高/低表达腺病毒的加入对caspase-3表达水平影响最为明显,低表达PP2A组caspase-3表达被完全抑制,凋亡水平降低。体内实验:昆明种小鼠高糖高脂饲料喂养4周后腹腔注射小剂量STZ构建糖尿病心肌病模型,并持续腹腔注射给予药物2周。结果显示:与空白对照组相比,模型组小鼠心脏/体重比值增大,HE染色的结果显示模型组心肌细胞肥大、细胞颜色变淡、细胞核增大、部分细胞接触部分出现融合。与模型组相比,OA组心脏/体重比值下降明显,FTY720给药组心脏/体重比值增大,HE染色的结果显示FTY720组能明显减轻心肌病变程度,而OA组明显加重;与空白组相比,模型组小鼠血清中MDA、CAT、NOS等酶的含量升高以及SOD含量下降。与模型组相比,FTY720组MDA、CAT、NOS等酶的含量升高;Western blotting结果显示,模型组Nrf2蛋白表达升高,自噬升高,凋亡抑制。而与模型组相比,OA组Nrf2蛋白表达下降,自噬降低,凋亡抑制,FTY720组Nrf2蛋白表达升高,自噬水平变化不大,凋亡升高。结论:本课题首次研究了 PP2A/Nrf2在糖尿病心肌病中的作用,并对其机制进行了探究。研究发现,出现糖尿病心肌病时PP2A表达升高,心肌细胞保护性自噬升高,凋亡升高。这种保护性的自噬、凋亡升高可能是通过启动抗氧化还原途径,调控Nrf2的表达实现的。但是,对于PP2A如何调控Nrf2以及进一步调控自噬和凋亡保护心肌细胞仍需进一步研究。