研究背景:骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓中一种非造血类干细胞。近些年来的研究发现,MSCs具有多向分化潜能、低免疫原性和易于体外扩增等特点,因此受到医学应用领域的广泛关注。目前,运用MSCs移植进行细胞替代治疗,已被广泛引用于研究治疗各种缺血或损伤性疾病以及器官移植抗免疫排斥反应等,并取得了初步效果,干细胞替代治疗有望成为临床上一种新的治疗手段。然而,临床应用研究中发现,MSCs移植后,能在局部停留、分化的细胞较少,难以满足组织修复的需要。因此,寻求促进较多的MSCs向受损组织迁移、定居进而分化成特定的组织细胞,成为目前细胞替代治疗中亟待解决的问题。目前,运用骨髓MSCs移植替代治疗主要有两种方式:经局部血管输入MSCs法和损伤组织局部注射法。其中,经局部血管输入法是最常用的方法。经局部血管输入的MSCs首先需要穿过毛细血管内皮,向目的器官或组织定向迁移或“归巢”,才能在局部微环境的作用下进行分化,发挥修复治疗作用。研究发现,MSCs有向缺血或损伤组织归巢的特征,推测在这一过程中,粘附分子和趋化因子可能起关键作用。目前对于骨髓MSCs“归巢”分子机制的研究尚少。因此,本文拟通过研究大鼠MSCs粘附分子表达及其与血管内皮的粘附机制,探寻促进MSCs向损伤组织“归巢”的有效方法,希望对临床应用提供有力证据。目的:研究炎性因子对骨髓MSCs粘附分子表达及其干细胞特异性标志物的影响,探讨运用较少剂量的炎性因子刺激MSCs粘附分子的有效表达、促进移植的MSCs向局部组织迁移的可行性。方法:采用全骨髓直接贴壁法获取大鼠原代MSCs,体外培养至第三代用于以下实验:(1)将培养的骨髓MSCs分别用不同浓度(2～20 ng/ml)的肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激24h,采用流式细胞术检测细胞表面粘附分子的表达率:血管细胞粘附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1),细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1),L-选择素(L-selectin),迟反应性抗原(Very late activation antigen,VLA-4)的表达率;(2)分离培养大鼠主动脉内皮细胞,分别用上述几种浓度的TNF-α预刺激的MSCs与大鼠主动脉内皮细胞共同培养12h,计数粘附的MSCs,与细胞流式结果相结合,分析得出最佳TNF-α因子的刺激浓度;(3)流式细胞术鉴定TNF-α刺激后MSCs特异性抗原的变化;(4)制作大鼠后肢缺血损伤模型,24h后经颈静脉输注经四甲基吲哚羧花青高氯酸盐(1,1-Dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine Iodade)标记、10 ng/ml的TNF-α预刺激的MSCs。输注MSCs 24h后取后肢肌肉组织,做冰冻切片,荧光显微镜下计数组织中的MSCs数目。以上实验均设不加TNF-α刺激组作空白对照。结果:(1)生理状态下,大鼠骨髓MSCs表面粘附分子ICAM-1表达较高,而其它粘附分子VCAM-1、L-selectin、VLA-4表达较低;TNF-α刺激后,粘附分子VCAM-1表达升高,且表达率呈浓度依赖性;ICAM-1、L-selectin、VLA-4的表达在TNF-α刺激前后无明显变化;(2)10 ng/ml、20 ng/ml TNF-α预刺激的MSCs与血管内皮细胞粘附能力明显增强;(3)用10 ng/ml的TNF-α预刺激MSCs,其表面干细胞标志物没有明显改变;(4)将10 ng/ml TNF-α预刺激的MSCs移植到大鼠体内,损伤肌肉组织内的MSCs数目明显多于对照组。结论:(1)炎性因子TNF-α能够明显增强大鼠MSCs表面粘附分子VCAM-1的表达,但对大鼠MSCs表面粘附分子ICAM-1、L-selectin和VLA-4的表达没有影响。(2)10 ng/ml的TNF-α能有效促进MSCs与血管内皮细胞的粘附,提高MSCs向受损部位迁移。其机制可能与MSCs表面粘附分子VCAM-1表达升高有(3)低剂量的TNF-α对大鼠MSCs干细胞特征没有明显影响。(4)首次采用主动脉内膜外翻法成功培养大鼠主动脉内皮,证明这是一种简单有效的小血管内皮细胞培养新方法。(5)首次用血栓颗粒悬液制作大鼠后肢缺血模型,证明栓塞效果理想。