高尿酸血症(hyperuricemia, HUA)是一种嘌呤代谢异常,血液尿酸水平异常升高的遗传相关性疾病。主要病因是体内尿酸的排泄减少和(或)生成增加。尿酸是嘌呤核苷酸类和游离碱基转化过程中的最终酶产物,肾脏有机阴离子转运体在维持体内尿酸的重吸收与分泌之间的平衡有显著性意义。尿酸的重吸收和分泌之失衡是导致高尿酸血症的主要原因。西药治疗高尿酸血症效果明显,但大多有严重的副作用产生,使得在临床的应用受到局限。然而中药治疗高尿酸血症,能够在体内发挥多靶点作用,平衡体内尿酸的重吸收与分泌,疗效确切,副作用小。复方土茯苓颗粒为广州军区广州总医院医院制剂,是治疗高尿酸血症的常用方,由土茯苓、牛膝、王不留行、山慈菇等药材制成。土茯苓作为君药,主要含有二氢黄酮类,如落新妇苷、异落新妇苷,有效成分落新妇苷有抗炎、利尿作用。牛膝作为臣药,主要含有甾酮类,如p-蜕皮甾酮、牛膝甾酮,有效成分p-蜕皮甾酮有促进蛋白合成,免疫调节作用。复方土茯苓颗粒方主要通过泄浊祛邪、化湿清热的作用,达到治疗高尿酸血症和痛风病的效果。前期,课题组已对本方做了大量的试验研究,制定了初步提取工艺、质量标准研究,通过有效部位总黄酮、总皂苷的分离,研究有效部位对尿酸转运蛋白1和黄嘌呤氧化酶活性抑制,证明了药物体外药理学机制。通过动物试验证明了复方土茯苓颗粒初步药效学,为新药研发提供了试验基础。本课题对该制剂按照国家中药新药申报要求,在制剂学、质量标准等方面进行研究。目的优化复方土茯苓颗粒提取、澄清、成型工艺,确立最佳制备工艺,节约成本,在中试放大实验中操作稳定可行；建立复方土茯苓颗粒质量标准,通过落新妇苷、p-蜕皮甾酮、总黄酮含量测定,用于复方土茯苓颗粒质量控制；研究复方土茯苓颗粒初步药效学,从体外药效学方面研究新工艺可行,为复方土茯苓颗粒申请新药奠定基础。方法1.复方土茯苓颗粒提取工艺研究采用Box-Behnken效应面法,应用HPLC.UV,以落新妇苷提取率、总黄酮提取率和出膏率的总评“归一值”为因变量,通过对提取次数、提取时间、加水量因素各水平进行多元线性回归及二项式拟合,考察提取因素的影响,优选复方土茯苓颗粒提取工艺条件。2.ZTC1+1.Ⅱ用于复方土茯苓颗粒提取液的澄清工艺研究应用HPLC.UV的方法,以落新妇苷保留率、总黄酮保留率为评价指标,分别考察药液浓度、澄清剂用量、加入澄清剂A组分或者B组分时药液温度、搅拌速率、保温时间及静置时间对澄清效果的影响。在单因素分析的基础上,应用正交实验设计优化澄清工艺条件,确定ZTC1+1-Ⅱ天然澄清剂用于复方土茯苓颗粒提取液澄清的最佳工艺。通过落新妇苷保留率、总黄酮保留率的计算,与原有的醇沉工艺进行比较研究。3.复方土茯苓颗粒成型工艺研究首先考察辅料的用量,通过颗粒质量检查、吸湿性、流动性研究,确定辅料用量。然后,以溶化性、合格率、落新妇苷含量、总黄酮含量的总评“归一值”为因变量,通过对混合辅料比例(糊精：可溶性淀粉),辅料倍数(混合辅料与稠膏比),乙醇浓度,干燥温度为主要影响因素,对因变量进行多元二次项回归拟合,采用星点设计-效应面法优选复方土茯苓颗粒成型工艺。4.复方土茯苓颗粒质量标准研究采用薄层色谱(TLC)法以对照药材、阴性对照品为对照对方中试产品中土茯苓、牛膝的定性鉴别；采用高效液相色谱法(HPLC)对方中的主要有效成分落新妇苷、p-蜕皮甾酮进行含量测定,制定制剂中落新妇苷的含量限度范围,落新妇苷含量测定：色谱条件：AgilentHC-C18柱(4.6mm×250μm),流动相：乙腈-水(20：80),流速1ml·min-1,检测波长290nm,柱温30℃,进样量10μl。β-蜕皮甾酮含量测定：色谱条件,AgilentHC-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相：乙腈-水(17：83)；流速：1mL·min-1,柱温：30℃,检测波长：243nm。通过色谱条件的筛选,方法学验证,建立稳定可行的含量测定方法。采用紫外分光光度计(UV)法对方中的主要有效部位总黄酮进行含量测定,制定制剂中总黄酮的含量限度范围,建立稳定可行的质量标准。5.复方土茯苓颗粒初步药效学比较研究培养小鼠肾小管上皮细胞(RTECs),通过CCK法考察药物作用的浓度和时间,利用细胞尿酸吸收功能测试,检测药物对尿酸吸收的抑制作用,通过多组均数比较采用单向方差分析,对不同浓度抑制肾小管上皮细胞效果进行比较。利用药物抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)活性,降低黄嘌呤生成尿酸量,利用尿酸试剂盒检测尿酸生成量,并且通过不同药物抑制黄嘌呤氧化酶活性大小,通过线性回归求出IC50,来对不同药物进行比较研究。结果1.采用Box-Behnken效应面法优选复方土茯苓颗粒提取的最佳工艺：提取3次,每次1.4h,加水量9.8mL·g-1,落新妇苷提取率1.9906mL·g-1,总黄酮提取率54.4355mL·g-1,出膏率8.5581%g·g-1,总评值实测值与预测值相对偏差+1.54%。与原提取工艺比较,提取率、出膏率均提高,经济可行。2.在药液浓度为1:5,ZTC1+1-Ⅱ2组分(浓度为1%)用量分别为6%(A),3%(B)的药液体积,搅拌速率为100r·min-1,静置时间为24小时的工艺下,落新妇苷保留率为88.06%,总黄酮保留率为83.27%,综合评分为86.62。与醇沉工艺比较,落新妇苷保留率、总黄酮保留率均提高。3.样品提取液经浓缩滤液至相对密度为1.15～1.17的稠膏,将稠膏与混合辅料(可溶性淀粉：糊精=1.5：1)以1：2,乙醇浓度70%,干燥温度70℃,在此条件下,溶化性为3.99min,合格率预测值为90.34%,落新妇苷含量预测值为0.0638%g·g-1,总黄酮含量预测值为2.0786g·g-1,OD预测值为0.894。4.确定了成品中土茯苓、牛膝的薄层鉴别方法和落新妇苷、p-蜕皮甾酮的HPLC的含量测定,制定了制剂中落新妇苷、p-蜕皮甾酮的含量限度范围,落新妇苷含量不低于0.7374mg·g-1,p-蜕皮甾酮含量不低于0.0943mg·g-1；总黄酮UV法的含量测定,制定了制剂中总黄酮的含量限度范围,总黄酮含量不低于12.356mg·g-1。5.复方土茯苓颗粒1、2高浓度组(100、50g-L-1)对小鼠肾小管上皮细胞生长有抑制作用,低浓度组药物(25、10、5g·L-1)对细胞生长活性无显著影响；在低浓度梯度范围(25、20、15、10、5g-L-1),复方土茯苓颗粒1对细胞尿酸吸收抑制程度高于复方土茯苓颗粒2的作用;黄嘌呤氧化酶活性试验表明复方土茯苓颗粒1、2对黄嘌呤氧化酶抑制率的IC50值分别为83.59μg·ml-1、94.5μg·ml-1。结论采用Box-Behnken效应面法,考察了提取时间、提取次数及加水量对复方土茯苓颗粒提取效果的影响,同时引入总评“归一值”对多指标进行处理,确定各因素的最佳值,使试验模型具有更好的预测性,从而优化了复方土茯苓颗粒的提取工艺。实验经过定量指标,以综合评分指标体系来判断不同澄清方法的澄清效果,通过单因素考察,确定因素及水平,利用正交实验来优选较佳精制工艺,并经验证实验表明结果稳定、可行,并且用于复方土茯苓颗粒澄清工艺后,制备颗粒有较好的防潮性。ZTC1+1-Ⅱ用于复方土茯苓颗粒提取液澄清,是切实可行。采用四因素五水平的星点设计-响应面法优选的最佳成型工艺,制备所得的颗粒粒度适中,外观均匀美观,验证试验结果也表明,建立的数学模型可靠,具有良好的预测性。建立稳定可行的质量标准,通过初步药效学比较研究,证明优化工艺可行、稳定。可用于新药临床前试验,为新药申请提供试验基础数据。