论文部分内容阅读
背景与目的急性白血病,指的是血液或骨髓中的幼稚细胞大于20%,急性白血病常使用免疫标记物来确定其类型,将其分为髓系或淋巴系白血病。急性髓细胞性白血病(AML)是成年人中最常见的急性白血病,在美国每年因白血病引起的死亡人数最多。急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种以大量未成熟淋巴细胞呈克隆性增殖为特征的血液系统恶性肿瘤。ALL是儿童时期最常见的恶性肿瘤,约占15岁以下儿童癌症诊断的25%。随着白血病细胞基因组学和表观基因组学的进步以及现代治疗方案的发展,儿童ALL的总体存活率(overall survival,OS)现已超过80%,但15-35%的患儿仍会复发,而多次复发ALL的预后极差,对这些病例的治疗将变得越来越具有挑战性。在过去的十年中,癌症治疗的又一种新型治疗选择是基于自身免疫反应的激活,而其中的典型代表就是嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T(CAR-T)细胞。CAR基因是基于识别肿瘤细胞表面靶抗原的单链抗体(Sc Fv)和跨膜区、共刺激因子如CD137(4-1BB)、CD28等和CD3ζ基序组成的非天然嵌合基因,通过慢病毒包装和感染激活的免疫活性细胞如T细胞、NK细胞等,使病人自身T或NK细胞发生重定向而发挥肿瘤细胞的特异性靶向杀伤和清除功能。而针对肿瘤相关抗原编程的CAR可以快速且均匀地复制,具有超生理活性的CAR修饰的T细胞可特异性识别肿瘤相关抗原并呈快速扩增,成为神奇的“活”的药物,,发挥抗肿瘤的即时和长期作用。特别是,用CAR重定向到癌症患者T细胞的过继转移已经实现白血病的显著缓解,其中,抗CD19 CAR-T细胞产物CTL019(tisagenlecleucel,Kymriah,Novartis)用于儿科复发/难治性B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)是第1个被美国食品和药物监督管理局(FDA)批准的基因修饰细胞疗法。白细胞介素15(interleukin-15,IL-15),分子量为:17.8KDa,是调节T和自然杀伤细胞活化和增殖的细胞因子,与白细胞介素2(IL-2)具有许多相似的生物学活性。目前有实验室采用将IL-15细胞因子与CAR-T结合的方法,构建第四代CAR-T细胞用于临床试验。研究表明,CD8+CD45RA+CCR7(Cxc Chemokine Receptor 7,CCR7)+亚群与B细胞恶性肿瘤患者注入的CAR-T细胞的体内扩增相关,IL-15在保留离体扩增CAR-T细胞CD8+CD45RA+CCR7+等细胞的方面优于IL-2,并且与IL-2相比,IL-15可以使暴露于系列抗原刺激下的CAR-T细胞具有更高的存活率,IL-15扩增的CAR-T细胞表达CCR7有助于将其有效归巢到次级淋巴器官,暴露于IL-15的CAR-T细胞能有效增加其在体内持久性和抗肿瘤活性。有研究表明,与不含IL-15结构的CAR相比,含IL-15结构的CAR具有可以使CAR-T细胞的持久性增加,中央记忆T细胞的数目增多,可以使杀伤靶细胞能力增强、减少复发的优点,但存在不知道确切的IL-15的适宜浓度,大家都处于摸索阶段的缺点,而这与目前没有标准指南供参考有关。我们假设,持续分泌的IL-15与CAR-T细胞体外共培养,有可能提高CAR-T细胞的扩增能力和维持能力,进而增加CAR-T细胞的抗肿瘤活性。目前还未有与CAR-T共培养的饲养层细胞分泌IL-15的文献报道。3A4CAR是本实验室前期构建成功的CD45亚类嵌合抗原受体,具有靶向白血病干细胞(leukemia stem cells,LSCs)的新型嵌合抗原受体。本研究拟构建稳定表达IL-15的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster cells,CHO)细胞株(CHO-h IL-15),对其所分泌的IL-15进行生物学活性鉴定,以CHO-h IL-15为饲养细胞,将其与CAR-T细胞共培养,观察持续分泌的IL-15对3A4CAR的增殖能力和杀伤活性的影响,为进一步提高其免疫治疗效果奠定基础。方法1 p Lenti-IL-15慢病毒表达载体的构建1.1 设计IL-15:检索文献,确定IL-15的基因结构;检索美国国家生物技术信息中心(NCBI),核实IL-15的基因序列,在完整基因片段两端设计Bam H I酶切位点以便后续质粒构建;送有关商业化公司合成IL-15全基因片段。1.2 扩增目的基因片段:返回的质粒均通过PCR、TA克隆、琼脂糖凝胶电泳验证,获得大量扩增的IL-15目的基因片段。1.3 构建p Lenti-IL-15慢病毒表达载体:用Bam HⅠ单酶切p Lenti-RFP-Blasticidin空载体,纯化后,与IL-15目的基因片段一起,通过T4连接酶在16℃30min进行连接反应。经涂菌、挑克隆、摇菌、测序后,构建成p Lenti IL-15表达载体。1.4 瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO):抽提IL-15的转染级质粒;使用脂质体法转染CHO细胞,48h后荧光观察;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-15的浓度。2 Plenti-IL-15在CHO细胞中成功表达并亚克隆化2.1 杀稻瘟菌素(blasticidin)在CHO细胞中最佳筛选浓度的选择:设置不同的杀稻瘟菌素浓度的梯度,观察CHO细胞的生长存活情况,选择当CHO全部死亡时的杀稻瘟菌素的最小浓度为最适筛选浓度进行下一步实验。2.2 Plenti-IL-15稳定感染CHO细胞:人胚肾细胞(293T)为包装细胞,共转染包装质粒和表达质粒,获得携有IL-15基因的慢病毒颗粒,逆转录-多聚酶链反应(reverse transption-polymerase chain reaction,RT-PCR)法测定慢病毒滴度;慢病毒感染CHO细胞。2.3验证IL-15的表达:通过RT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质免疫印迹(Western Blot)、免疫荧光、流式细胞术(FCM)等方法验证IL-15在CHO细胞及其培养上清中的表达量。2.4培养CHO-IL-15单克隆细胞株:通过杀稻瘟菌素抗性加压、亚克隆技术获得单克隆细胞株(CHO-IL-15),免疫荧光法检测IL-15蛋白在CHO细胞中的表达。3 CHO-IL-15对3A4CAR-T的活性影响3.1嵌合抗原受体3A4-CAR慢病毒包装及滴度鉴定3.2慢病毒感染T细胞3.3流式细胞术验证3A4CAR在T细胞膜上的表达3.4 CHO-IL-15对正常人外周血T细胞的活性影响:设置不同细胞数梯度的T细胞与CHO-IL-15的数量比,单纯的T细胞对照组和商业化重组人IL-15与T细胞培养,观察T细胞的增殖情况。3.5 CHO-IL-15对3A4CAR-T细胞株的活性影响:设置不同细胞浓度梯度的3A4CAR-T与CHO-IL-15细胞株细胞的数量比(2:1、5:1),以单纯的3A4CAR-T细胞、3A4CAR-T与普通的CHO细胞共培养(5:1)和商业化重组人IL-15与3A4CAR-T共培养作为对照组,观察3A4CAR-T细胞的增殖情况及杀伤功能。结果1 p Lenti-IL-15慢病毒表达载体的构建1.1通过查阅资料确定人的IL-15的基因序列:目的基因片段共489 bps。1.2扩增目的基因片段:根据基因片段结构,设计包含阅读框两端序列的上下游引物,对返回的质粒经PCR、TA克隆,获得大量扩增的IL-15目的基因片段,电泳结果显示在约500bps处有明亮条带,与设计基因大小相符。进一步切胶送商业化公司测序及用DNA-MAN软件进行基因序列比对,结果显示,序列与预计序列完全一致。1.3构建p Lenti-IL-15慢病毒表达载体:用Bam HⅠ单酶切p Lenti-RFP-Blasticidin空载体,纯化后,与经Bam H I酶切的IL-15目的基因片段一起,在T4连接酶存在下,16℃30min连接反应。经涂菌、挑克隆、摇菌、测序后,对比结果显示:p Lenti-IL-15慢病毒表达载体结构中的IL-15基因序列及整合位置与预计设计结果一致,表明载体构建成功。1.4 p Lenti-IL-15慢病毒感染CHO细胞:使用脂质体法,将转染级质粒p Lenti-IL-15感染CHO细胞,48h后在576nm波长激发光激发下荧光观察发现有红色荧光,ELISA法检测培养上清中IL-15的表达,结果显示,IL-15浓度为43pg/ml,经FCM检测含红色荧光的细胞占25.9%。2 IL-15在CHO细胞成功表达并亚克隆化2.1杀稻瘟菌素在CHO细胞中最佳筛选浓度的选择:当杀稻瘟菌素浓度为10μg/ml及以上时,CHO细胞全部死亡,确定10μg/ml是杀稻瘟菌素的最佳筛选浓度。2.2 p Lenti-IL-15稳定感染CHO细胞:以293T细胞成功包装了表达IL-15基因的慢病毒颗粒。通过RT-PCR鉴定,原液病毒上清的滴度在4x10~6/ul数量级;以500ul的病毒体积,2x10~9的病毒量与10~6CHO数的比率,5%CO2,37°C培养条件下共培养进行慢病毒感染,2天后,在576波长激发光激发,荧光显微镜下观察到慢病毒质粒自身携带的红色荧光细胞,FCM定量检测显示其阳性率为80%,证明慢病毒成功感染CHO细胞成功。2.3 CHO-IL-15细胞分泌人IL-15的验证:将上述慢病毒成功感染的CHO细胞即CHO-IL-15分别接种于6孔板每孔2ml培养皿中,每孔加10~6 CHO-IL-15细胞,在5%CO2,37°C孵箱中培养1、2、3天,收集培养上清,贴壁细胞用0.25%的胰酶-EDTA溶液孵育消化2 min,收集细胞,以PBS(p H 7.4,0.1M),500g x 5min,离心洗涤2次后,抽提RNA。经RT-PCR扩增,在CHO-IL-15细胞中扩增到IL-15基因片段;再以ELISA法检测培养上清中的IL-15浓度为288pg/ml;荧光显微镜下可观察到实验组有绿色荧光,而对照组细胞则未见绿色荧光;FCM确定了含红色荧光的细胞可以高达85%。2.4 CHO-IL-15单克隆细胞株的建立:将上述经CHO-IL-15细胞经有限稀释法在96孔板中进行克隆化培养,用荧光显微镜观察克隆化生长的细胞内荧光,经三次克隆化培养后,获得稳定分泌IL-15的CHO-IL-15单克隆细胞株;用羊抗兔Ig G FITC二抗对CHO-IL-15细胞进行免疫荧光染色后,荧光显微镜下观察,发现实验组的GREEN场中有明亮绿色荧光蛋白表达,而空载组和空白对照组则无绿色荧光;实验组和空载组的红色荧光场中有红色荧光蛋白表达,而空白对照组则无任何荧光出现,提示感染后的CHO-IL-15单克隆细胞株细胞能成功表达IL-15目的蛋白。3 CHO-IL-15细胞对3A4CAR-T细胞的活性影响3.1 3A4CAR慢病毒包装及滴度鉴定:根据本实验室前期研究结果,成功包装3A4CAR慢病毒颗粒,经超速离心浓缩20倍的慢病毒溶液,定量PCR测定测得其滴度达9.25x10~5copes/μl。3.2 慢病毒转染正常人外周血T细胞实验:经伦理审查同意,获得正常体检儿童外周血2ml,肝素抗凝,用Ficoll淋巴细胞分离液1500rpm x 15min分离中间层单个核细胞(MNC),然后,用100ul慢病毒对10~5T细胞感染,在5%CO2,37°C培养条件下培养24小时,培养T淋巴细胞;再慢病毒稳转T淋巴细胞。3.3 流式验证3A4CAR在T细胞上的表达:加GAM抗体、链霉素PE来间接标示,再加CD5 APC、CD45 Per CP来标记,看3A4CAR是否成功转染T细胞。3.4 CHO-IL-15对T细胞的活性影响:发现当T:CHO-IL-15=5:1时,T细胞的增殖倍数最大,大于单纯的T对照组和重组的人IL-15与T培养组,各实验组的增殖时间都明显延长。3.5 CHO-IL-15对3A4-CAR-T的活性影响:发现当CAR-T:CHO-IL-15=2:1时,CAR-T细胞的增殖倍数最大,大于其他对照组,且杀伤能力增强,但CAR-T的增殖时间没有明显延长。结论(1)p Lenti-IL-15慢病毒表达载体构建成功。(2)通过慢病毒载体p Lenti-IL-15感染将人IL-15基因成功转入CHO细胞中表达,并成功建立能持续稳定分泌人IL-15的单克隆细胞株CHO-IL-15。(3)CHO-IL-15较对照组显著增加T细胞的增殖倍数,延长生存时间。(4)CHO-IL-15可促进CAR-T细胞的增殖,扩增倍数增加且杀伤能力增强,但CAR-T细胞的生存时间没有明显延长。