马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata (Say))是我国重要的进境植物检疫性有害生物,国外已成功开发出基于苏云金杆菌和刺糖多孢菌的细菌性杀虫剂,而国内利用病原细菌等微生物防治该虫的研究报道很少。本研究从新疆疫区采集田间自然死亡的马铃薯甲虫标本,在室内分离昆虫病原细菌,经致病性试验筛选出具有潜在开发应用价值的生防菌并对强致病菌进行鉴定,研究生防菌的培养特性以及生防细菌与虫生真菌对马铃薯甲虫的协同控制效果。1.马铃薯甲虫病原细菌分离及其降解酶活性测定：从新疆马铃薯甲虫疫区采集的发病马铃薯甲虫上分离纯化得到126个细菌菌株。其中能降解几丁质的20株,能降解蛋白质的26株,能同时降解这两种物质的10株,初步认为这些具降解酶活性的菌株可能是马铃薯甲虫的病原细菌,初步确定它们均为芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌。2.具降解酶活性菌株对家蚕的致病性测定：用具降解酶活性的36个菌株的细胞悬浮液(浓度：2.0×109cfu/mL)接种2龄家蚕幼虫。结果表明,有21个菌株表现出致病性,其中8个菌株致病力较强,接种后1-2d就出现蚕体死亡,接种7d的累积死亡率(LR7d)达50%以上,致死中时(LT50)都小于7.4d,菌株CPB008、CPB012、CPB016致病力最强,LR7d达70%以上,LT50分别为3.2d、3.3d和3.6d,这为后期进行马铃薯甲虫生防菌的筛选奠定了基础。3.昆虫病原细菌对马铃薯甲虫的致病性测定：用对家蚕有致病性的21个菌株的细胞悬浮液(浓度：2.0x109cfu/mL)接种各龄马铃薯甲虫后观察。有11个菌株对1、2龄幼虫具有致病性,其中6个菌株对1龄幼虫致病力非常强,接种后1-2d虫体开始死亡,LR7d达50%以上,LT50为3.8-6.8d,致死中浓度(LC50)为0.088-2.555x109cfu/mL, CPB008、CPB012和CPB016对1龄幼虫的致病性最强,LR7d达70%以上,LT50分别为3.8d、4.1d和4.3d,LC50分别为0.088、0.383和0.316x109cfu/mL;所有菌株对2龄幼虫的致病性稍弱,LR7d为21.0-62.6%,LT50为4.1-10.3d,但(CPB008、CPB012和CPB016菌株的LR7d仍超过50%。由这些细菌致死的马铃薯甲虫虫体变黑腐烂,有的有褐色液体流出,通过柯赫氏法则验证它们均为马铃薯甲虫的病原细菌。本研究结果认为,菌株CPB008、CPB012、CPB016、CPB072、CPB108和CPB111是马铃薯甲虫的强致病菌,其中CPB008、CPB012和CPB016在马铃薯甲虫的生物控制中将具有巨大的开发应用价值。4.强致病菌株对马铃薯甲虫的田间控制效果及生防菌筛选：以前期试验筛选的6个强致病菌株为供试菌株,1龄马铃薯甲虫为供试昆虫,清水和常用Bt制剂为对照进行田间试验。结果表明,有3个菌株在接种10d后的累计死亡率(LR1od)达到40%以上,分别是CPB008(49.9%)、 CPB012(43.1%)和CPB016(41.0%);另外3个菌株在田间对1龄幼虫的LR1od分别为37.5%(CPB108)、28.4%(CPB072)和21.1%(CPB111),而作为对照的Bt制剂对1龄幼虫的致死率仅有24.9%,显著低于除菌株CPB111以外的供试菌株,6个菌株表现出较好的田间防治效果,CPB008、 CPB012和CPB016的防治效果最好,确定为马铃薯甲虫的生防细菌。5.强致病病原细菌的鉴定：1).形态学观察：6株病原细菌在LB培养基上单胞菌落为乳白色；革兰氏染色阳性；菌体杆状,在细胞的一端形成芽孢,芽孢染色为绿色。其中CPB008、 CPB012、 CPB016和CPB111的单胞菌落圆形,边缘不整齐;菌体长形,两端钝圆与中部同样大小；菌体大小为1.17-1.94x6.12-7.24μm;菌株CPB072和CPB108单胞菌落圆形或近圆形,边缘整齐；菌体中间粗两端略尖；菌体大小为1.79-2.4x6.32-7.29μm。2).生理生化特性：6个菌株都能利用D-葡萄糖、D-果糖、甘露醇、NH4H2PO4和KNO3,而不能利用D-木糖；接触酶反应、淀粉水解、V-P试验和明胶液化试验均呈阳性,吲哚试验呈阴性,都不产生H2S；在2%NaCl的盐浓度和30、37℃下生长良好。3).16S rDNA序列分析：采用细菌16S rDNA通用引物,以6个菌株的基因组DNA为模板分别进行PCR扩增,得到1012-1268bp的16SrDNA核心序列(GenBank登录号分别为：JF795483(CPB008)、JN896990(CPB012)、 JN896992(CPB016)、JN896991(CPB072)、JF505384(CPB108)和JN896993(CPB111))。4).鉴定：结合形态学、生理生化特性和分子生物学方法,CPB008、CPB012、CPB016和CPB111鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis), CPB072和CPB108鉴定为萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)。6.生防菌株的培养特性：在供试的8种培养基中,CPB008、CPB012和CPB016的最适培养基分别为LB、NA和NA培养基；3个菌株的最适生长pH、温度和盐浓度分别为7.0、37℃和2%NaCl；在供试的8种碳源和氮源中,菌株对葡萄糖碳源和蛋白胨氮源利用最好；3个菌株的生长特性基本一致,0-2h处于延滞期,2-16h为对数生长期,16h后处于稳定期。7.生防细菌CPB008与白僵菌MJ-07的协同杀虫效果：试验结果表明,MJ-07+CPB008显著提高了对马铃薯甲虫的控制效果。室内接种后,MJ-07+CPB008引起虫体始见死亡时间提前3d；对1龄和2龄幼虫的LR14d达到95%以上,对3、4龄幼虫的LR14d也超过了60%；且幼虫体重增长缓慢,所需发育时间长；田间接种2周后调查,对1龄和2龄幼虫的防治效果分别达到45.2%和42.2%,作为对照的Bt制剂分别只有24.9%和23.2%。昆虫病原细菌是自然界中广泛分布的一类宝贵的生物资源,随着科学技术的进步和有害生物综合治理等植保方针的提出,生物防治将在马铃薯甲虫的综合治理中发挥重要作用。本研究从马铃薯甲虫上分离鉴定了2种6株(苏云金杆菌4株、萎缩芽孢杆菌2株)对马铃薯甲虫有强致病活性的芽孢杆菌(Bacillus)菌株,再通过室内和田间测试筛选出3个菌株作为马铃薯甲虫的生防菌,且生防细菌与虫生真菌协同作用能显著提高对马铃薯甲虫的杀虫控制效果,它们在马铃薯甲虫生防制剂的研发中将具有重要的应用潜力。