论文部分内容阅读
已知目前在导向药物研究中，单抗偶联毒素的大分子量成为其应用于实体瘤治疗的主要障碍。与表皮生长因子受体特异性结合的配体寡肽GE7具有与表达EGFR的肿瘤细胞特异结合的特性，因此能以其为基础构建肿瘤靶向药物。本研究分别构建了EGFR配体寡肽与力达霉素构成的抗肿瘤基因工程强化融合蛋白SG-LDP-AE和力达霉素辅基蛋白rLDP，并分别对它们的活性进行了研究。此外，为了得到更小分子量的活性力达霉素，进一步对力达霉素辅基蛋白进行截短的尝试，构建了不同的截短的力达霉素辅基蛋白的重组融合表达质粒。 一、EGFR配体寡肽与力达霉素构成的抗肿瘤基因工程融合蛋白SG-LDP的构建及其抗肿瘤活性的研究 表皮生长因子受体EGFR过表达是多种上皮来源人体肿瘤的重要特性，且与患者不良预后有密切关系，因此，EGFR可以作为肿瘤导向治疗的理想靶点。大分子肽类抗生素力达霉素（lidamycin，LDM，又称C-1027）具有细胞毒作用强，体内抗肿瘤活性高的特点，是导向药物的理想“弹头”。力达霉素由辅基蛋白（LDP）和活性烯二炔发色团（AE）组成。LDP和AE可拆分和重建，因此可通过基因工程方法将EGFR特异性结合配体寡肽SG和辅基蛋白重组起来，然后加入发色团进行分子重建产生靶向药物。 本研究首先通过PCR扩增得到EGFR特异性结合的16肽GE7与力达霉素辅基蛋白融合的基因，将其克隆入质粒pET-30a（+）中，构建重组表达载体pET30GLDP。经酶切鉴定和序列测定后，又通过PCR扩增在上述基因前引入信号肽pelB基因序列，同时引入特异性酶切位点NcoI，然后将其克隆入质粒pET-30a（+）中，构建重组表达载体pET30SGLDP。经酶切鉴定和序列测定后，将载体pET30SGLDP转化入大肠杆菌BL21（DE3）starTM中，加入0.05mM IPTG进行诱导表达。通过SDS-PAGE和Western-blot分析外源蛋白的表达，表达产物主要以分泌表达的可溶形式存在于大肠杆菌发酵培养液上清中，表达含量占培养液上清的70％以上。利用羧基端的组氨酸六聚体尾以Ni-NTA His.Bind树脂进行目的蛋白的分离纯化，经透析后每升发酵液可得到约40mg活性蛋白，纯度达95％