猪血发酵菌株的诱变、鉴定与综合降解技术的研究

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本文研究了产血红蛋白酶菌株的鉴定、紫外与化学方法结合诱变,及其发酵猪血的条件。探索了纯酶酶解与微生物发酵相结合的多级生物降解猪血的工艺条件。本研究论文主要包括四个方面:(1)高产血红蛋白酶菌株硫酸二乙酯、紫外线诱变的研究采用硫酸二乙酯(DES)—紫外线诱变方法对短小芽孢杆菌出发菌(Lact5.Ⅲ.6)进行两次诱变育种。结果表明,采用1%(V/V)的DES诱变30min后15W紫外灯30cm照射30s,可定向选育出高产突变菌株并命名为Bacillus pumilus CN8,其分解血红蛋白的能力较出发菌株提高18.09%。遗传稳定性研究表明,Bacillus pumilus CN8具有良好的高产性能遗传稳定性。(2)诱变菌株CN8的红外光谱分析和16S rDNA序列测定采用傅立叶变换红外光谱非破坏性的分析了菌株CN8,在获得完整细胞组分的红外光谱信息基础上,进行了二阶导数光谱转换。结果表明,根据二阶导数光谱特征吸收峰可用来区分短小芽孢杆菌细胞的荚膜、芽孢、贮能物质等特殊结构物质。以在1 654cm-1附近的α-螺旋结构的蛋白酰胺带吸收峰与在1 601cm-1和1 403cm-1附近显示的羧基伸缩振动吸收峰可探测到细胞荚膜结构;根据在1617cm-1、1 372cm-1和1 569cm-1附近的吡啶二羧酸(DPA)的吸收峰可呈现出细胞内芽孢的存在;此外,可在二阶导数红外谱图中同时找到多聚β-羟基丁酸(PHB)细胞粒、荚膜、芽孢等结构的吸收峰。诱变菌株CN8经扩增、测序得到菌株的16S rDNA序列,GenBank接收号为EF185299。将菌株与其16S rDNA同源的序列,用ClustalX 1.18进行多重序列对比,用Phylip软件按邻位相连法构建16S rDNA系统发育树。菌株与Bacillus pumilus处于同一分支,相似性为99.6%—99.9%。将它鉴定为Bacillus pumilus。(3)多菌种混合发酵猪血的研究采用产血红蛋白酶能力强的诱变短小芽孢杆菌菌株CN8与产蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株W11、N14及分解碳水化合物的酿酒酵母混合发酵新鲜猪血,生产猪血水解多肽。对混合发酵的接种量、发酵温度、发酵时间、玉米粉添加量进行了研究。结果表明:多菌种混合发酵所用各种菌种的接种量分别为2%的CN8、0.5%的W11、0.5%的N14及0.2%的酿酒酵母(均为v/v);最适发酵温度为33℃,发酵时间为60h,不添加玉米粉。(4)猪血多级生物降解工艺的研究研究了不同中间处理过程对纯酶酶解猪血和微生物发酵猪血相结合的多级生物降解猪血水解度的影响。结果表明,多级生物降解猪血的最佳工艺条件是,先用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶(1:1)混合酶液酶底物浓度为8000U/g、底物浓度10%、pH=8.0、40℃水解8h后,真空浓缩水解液(45℃、真空度0.1MPa)至底物浓度为14%,最后调节pH=7.25,接种混合菌,各菌种所用接种量分别是2%(v/v)的短小芽孢杆菌CN8、0.5%(v/v)的枯草芽孢杆菌W11、0.5%(v/v)的N14,33℃,发酵72h。
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