论文部分内容阅读
猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）是引起猪病毒性腹泻的主要病原之一,由TGEV引起的疾病发病率和死亡率较高,最高可达100%。反向遗传技术为研究病毒的复制特性、致病特性、基因特性等分子机制和研制新型疫苗（嵌合疫苗、标记疫苗等）提供了科学手段。因此,建立起TGEV的反向遗传系统具有重要的科学意义。为了构建TGEV的反向遗传系统,本研究首先对中国经典弱毒疫苗株H165和新分离的流行强毒株AH进行了生物学特性研究。动物致病性试验表明,弱毒疫苗株H165对1周龄内仔猪不致病,不能引起仔猪发生腹泻、呕吐等临床症状,但其祖代强毒株H16和流行毒株AH能引起仔猪发病,表现为腹泻、呕吐,严重时为水样腹泻,甚至造成仔猪死亡（详细数据另行发表）;对其全基因组序列进行测定分析,中国经典疫苗毒株H165及其祖代强毒株H16及流行毒株AH的全基因组序列均具有Alpha-冠状病毒的特征,共编码9个不同的ORFs,基因顺序是5’-la-lab-S-3a-3b-sM-M-N-7-3’;对全基因组进行遗传演化分析,TGEV主要分为两个大群:一个大群是与Purdue毒株相类似,称Purdue like group,另一个与Miller毒株相类似,称Miller like group。中国经典疫苗毒株H165及其祖代强毒株H16的全基因组及各个结构基因和非结构基因均处在Miller like group分支中,说明它们是Miller样毒株。然而新分离的流行毒株AH的S基因、N基因、1a基因处于Miller like group分支中,但其E基因、M基因、1b基因、3a基因、3b基因、基因7却处于Purdue like group分支中,由此说明,AH株很可能是这两个大群的毒株在长期的进化中经过缓慢的变化从而产生的一种重组毒株;对强弱毒株氨基酸水平差异分析表明:ORF1a的3867P-R,S基因的48P-S,514L-P,E基因的23F-V,71I-L,3a基因的55A-S和基因7的76T-I可能是毒株由强致弱的关键位点;对H165株、AH株和PUR46-MAD株进行反向遗传系统构建关键位点分析,发现它们都具有相同的5’UTR小ORF。处于ORF1a和ORF1b之间的假结结构也是完全一致的,可以顺利形成假结结构并完成核糖体的-1移码。控制各基因转录水平的前导序列和转录调控序列并不完全一致,中国经典疫苗毒株H165的TRSS2、TRS3a、TRS3b、TRSM与已经验证成功工作的PUR46-MAD相应TRSs是不一样的,尤其TRSS2和TRS3b的核心序列都存在差异,但流行毒株AH株只有TRSM与PUR46-MAD不相同,且不处于核心区域。为了构建基于BAC系统的TGEV的全长质粒,首先对BAC操作系统进行了优化,成功建立起了BAC系统的质粒制备、酶切、连接、转化、阳性克隆筛选等方法。通过对流行毒株AH株P5代全基因组序列和pBeloBAC 11序列的分析,设计了一种将TGEV全基因组分为A（5’）、B、C、D（3’）四个片段的策略。首先在pBeloBAC 11载体的基础上构建一个包含NotI、BstBI、ClaI、NheI、XhoI、KasI、SacII多克隆位点的pBAC-AH-MCS质粒,然后利用融合PCR、酶切、连接的方法将上述四个片段逐个插入到该质粒中,并且将含有毒性序列的△ClaI片段（4418-9616）最后插入,从而得到了AH株的全长质粒pBAC-TGEV（AH）-FL,该全长质粒包含CMV启动子、HDV和BGH等元件;通过对中国经典疫苗毒株H165株的全基因组序列和pBeloBAC 11序列的分析,设计了一种将TGEV全基因组分为5’、A、B、C1、C2、3’六个片段的策略,首先在pBelo BAC ll载体的基础上构建了一个包含5’段、3’段的中间质粒pBAC-TGEV（H165）5’-3’,该中间质粒含有CMV启动子、HDV和BGH等元件,并含有后续克隆所需要的MluI、BbvCI、Nhe I、XhoI、KasI、SacII等多克隆位点,然后将上述A、B、C1、C2四个片段逐个插入到该中间质粒pBAC-TGEV（H165）5’-3’中,含有毒性序列的△ClaI片段（4418-9616）最后插入,从而得到了H165株的全长质粒pBAC-TGEV（H165）-FL。最后,设计并构建了缺失ORF3基因,插入报告基因GFP的全长质粒pBAC-TGEV（AH）-△3-TRSN-GFP和pBAC-TGEV（H165）-△3-TRSN-GFP。为了成功拯救病毒,首先建立起了两套基于稳定表达TGEV受体猪氨基肽酶N（pAPN）的细胞系（BHK-pAPN）的强弱毒转染拯救系统。经弱毒转染拯救系统验证,中国经典疫苗毒株的全长质粒pBAC-TGEV（H165）-FL可以成功拯救出病毒。经强毒转染拯救系统验证,流行毒株AH株的全长质粒pBAC-TGEV（AH）-FL也可以获得成功拯救。经TGEV N基因和M基因特异性引物验证分别可以扩增出1360bp和1131bp的特异性条带;感染拯救病毒的PK15细胞表现出TGEV特有的细胞膨大、聚合、脱落等病变效应;用抗TGEV N蛋白的单克隆抗体建立的IFA实验进行检测表明拯救病毒确实为TGEV;分子标签检测表明H165的拯救毒株确实完成了18997T-C的突变,AH的拯救毒株完成了18997T-C和16930G-C的突变;电镜观察表明拯救病毒株呈现冠状病毒特有的形态特征,病毒粒子呈现圆形或椭圆形,粒子大小较均一,纤突大而稀疏,围绕在病毒粒子周围。由此说明,中国经典疫苗毒株H165成功拯救,命名为rTGEV（a）-H165,流行毒株AH也获得成功拯救,命名为rTGEV（v）-AH。对不同代次病毒滴度进行测定,拯救毒株rTGEV（a）-H165和rTGEV（v）-AH随着代次的提高病毒滴度逐渐增高,至P4到P6代时达到高峰。对拯救毒株和亲本毒株进行生长曲线测定表明,它们呈现相似的生长特性。对该转染救毒试验进行多次重复表明,控制质粒纯度(OD260/OD280)在1.8-2.0之间,控制质粒浓度在100-200ng/μl之间均可以拯救出病毒,说明该系统稳定性非常好。最后,带有绿色荧光蛋白（GFP）的报告病毒rTGEV（H165）-GFP和rTGEV（AH）-GFP也获得成功拯救,并能稳定存在20代以上,说明构建的强弱毒反向遗传系统可以用于外源蛋白的稳定表达。