免疫系统包括天然免疫和适应性免疫。天然免疫是机体防御病原微生物感染的第一道防线。在天然免疫系统中最重要的一环就是模式识别受体PRRs对病原微生物模式相关分子PAMPs的识别。这些受体中TLRs，NOD like受体以及RNA Helicase是重要的胞外和胞内受体，参与到NFκB及IRF激活的信号通路，引起机体的炎症反应和抗病毒反应。适应性免疫是抗原特异的防预系统，它的激活导致B细胞分泌抗体和T细胞分泌细胞因子及其分化为效应细胞。天然免疫和适应性免疫不是独立的两个系统，相反，天然免疫的重要分子和信号通路可以激活适应性免疫。在这个机制中，TLRs信号通路是联系天然免疫与适应性免疫的纽带。 斑马鱼和高等脊椎动物一样具有天然免疫和适应性免疫。从上世纪90年年代起科学家已对斑马鱼适应性免疫进行研究，取得了许多重要的科学成果。科学家发现了斑马鱼T细胞和B细胞及其发育规律。在分子水平，Rag基因，这个参与抗体重排的重要分子的表达也在斑马鱼中的到证实。转基因斑马鱼等技术和实验方法也被应用于斑马鱼适应性免疫的研究。然而，斑马鱼天然免疫的研究才刚刚起步。2004年，Jault et al．and Meijer et al．同时报道在斑马鱼基因组中发现了TLRs分子家族及其衔接蛋白。他们做了一些病原微生物刺激试验，发现了基因的表达上调模式。他们得到了一些初步的结果，但是还没有阐明这些受体和衔接蛋白在斑马鱼中真正的的功能。 在人的TLRs系统中，TRIF蛋白是一个重要的衔接分子，参与到TLR3和TLR4介导的干扰素激活信号通路。同时，在高等脊椎动物中另一条不依赖于TLRs和TRIF介导的RIG-I/MAVS信号通路也被发现。这是一条胞内干扰素激活的通路。这两条途径交汇于IRF3/7的激活和干扰素的上调表达，并进一步通过干扰素的产生激活适应性免疫。因此这两个途径是重要的信号通路，他们协同作用共同抵御胞外和胞内病毒感染。文献已经报道了斑马鱼TLR3基因的克隆与功能分析。同时，通过同源分析我们在斑马鱼基因组文库中分别找到了与人TRIF基因、RIG-I基因以及MAVS基因的同源的EST序列。这个结果提示斑马鱼中也存在这两种信号通路。基于这样的分析结果，我们开展了对这几个斑马鱼天然免疫基因的序列克隆和功能研究。 首先，基于已知的斑马鱼TRIF，RIG-I和MAVS基因的EST序列设计引物，我们分别进行了5和3RACE实验，以期获得基因的全长cDNA序列。虽然获得了斑马鱼RIG-I基因的3端序列，但多次尝试却未获得5端序列。幸运的是，我们成功的获得了斑马鱼TRIF和MAVS基因的5和3端序列，并通过拼接得到了两个基因的全长cDNA序列。分析序列发现，斑马鱼TRIF基因含有TIR结构域，斑马鱼MAVS序列含有CARD结构域。两种结构域是两种分子所属基因家族的特征性结构域。同时，序列分析也发现在保守结构域外斑马鱼基因序列与人同源基因序列的存在不同点，这暗示在斑马鱼中TRIF和MAVS所介导的信号通路可能存在鱼类特有的机制。 其次，我们对斑马鱼TRIF基因和MAVS基因进行了功能研究。通过克隆技术将基因克隆于真核表达载体后，利用萤光素酶报告基因系统检测目的基因在信号通路中的作用。结果发现，斑马鱼TRIF基因与人类同源基因一样可以激活NFκB响应启动子和干扰素启动子报告基因表达；而且TIR结构域保守位点突变后，斑马鱼TRIF基因丧失了激活干扰素信号通路的功能。同时，对斑马鱼MAVS的功能研究，我们得到了有意义的发现。斑马鱼MAVS基因在哺乳动物细胞系中不能激活干扰素启动子报告基因的上调表达，这与其人同源基因不同。分析认为一方面是斑马鱼MAVS基因不像TRIF基因那样保守，不能利用人信号通路的组成分子传递信号。另一方面提示斑马鱼MAVS基因功能可能与其同源基因存在差异。序列分析发现斑马鱼MAVS基因缺失了C端序列；相反，人的此段序列不仅决定其特定的亚细胞定位特征，而且是其行使干扰素激活功能所必须的。 再次，对于基因的亚细胞定位特征我们也做了深入研究。一方面，激光共聚焦亚细胞定位实验发现斑马鱼TRIF基因位于细胞质内围绕细胞核呈现星状分布的特点。而且，与高尔基体特异标记基因载体共转染后发现斑马鱼TRIF基因与标记基因共定位，该结果提示斑马鱼TRIF基因是高尔基体定位基因。这是首次发现的斑马鱼TRIF基因的亚细胞定位特征，目前对人的同源基因也没有相关报道。同时，这个结果也显示斑马鱼TRIF介导的信号通路可能与亚细胞器有密切联系。另一方面，据报道人的MAVS基因定位于线粒体，而我们的实验结果显示斑马鱼MAVS基因在这个细胞质内表达，没有特别的亚细胞器定位特征。说明斑马鱼MAVS基因的定位特征在进化上不是保守的，而且这种定位特征可能也导致了基因的功能不保守性。 最后，为了研究基因表达模式与TLRs配体刺激的关系，本论文也进行了各种纯组分腹腔注射成体斑马鱼的实验。通过实时定量PCR技术检测基因表达，我们发现了一些有意义的结果。一方面，对于polyI：C刺激斑马鱼RIG-I和MAVS基因表达出现特异上调，而TLR3和TRIF基因表达水平却没有明显变化。这个结果显示在斑马鱼中RIG-I/MAVS信号通路对于polyI：C的刺激反应比TLR3/TRIF信号通路对同种刺激物的反应敏感。同时，LPS刺激可以引起IL-1β的表达上调，却不能同时诱导干扰素的表达上调。这个结果暗示，在TLR4的配体LPS刺激时，TLR4/TRIF介导的信号通路在斑马鱼中可能被阻断或者是不能完全行使功能，而这正是在斑马鱼中LPS所诱导的信号通路的特点。 综上所述，我们的工作取得了斑马鱼天然免疫研究的有意义的发现。我们对斑马鱼的天然免疫系统有了一定的认识，也为进一步深入研究这个系统提供了工作基础；而且，比较斑马鱼和高等脊椎动物的异同，也是脊椎动物天然免疫进化分析的重要开端。