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目的:骨髓干细胞是当前成体干细胞研究的热点,关于其多向分化潜能的研究更是层出不穷,在一定条件诱导作用下,可分化为多功能细胞,形成各种类型组织和器官,已有研究证实骨髓干细胞可向神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞等转化。体内外研究已证明骨髓干在肝细胞生长因子(HGF)和肝内微环境下可分化为肝实质细胞。但利用中草药诱导骨髓干细胞向肝系分化的尚少有研究。剔毒护肝方主要由黄芪、莪术、叶下珠经一定比例配置而成,是导师聂广教授经长期临床实践和动物体内外实验总结出的经验方。本研究采用剔毒护肝方及其拆方含药血清对大鼠骨髓干细胞进行诱导培养,观察其对骨髓干细胞增殖作用和向肝系分化的影响。 方法:Wistar大鼠40只,雄性,SPF级,体重220±20g,随机分为7组:剔毒护肝方组、黄芪组、莪术组、叶下珠组、生理盐水对照组、肝再生血清组、骨髓干细胞分离组,全部正常饮食。将剔毒护肝方组(1g/ml)及叶下珠(0.4g/ml)、莪术(0.3g/ml)、黄芪(0.3g/ml)组、生理盐水对照组,每日分别以10ml/kg体重灌喂大鼠。灌胃前在水浴箱内加热药物,每天2次,连续3天,于第4天1次给予全日剂量,1h后,2%戊巴比妥钠麻醉后下腔静脉无菌取血,离心得到药物血清,同组大鼠药物血清混匀,经56℃,30min灭活,-20℃保存备用。取Wistar大鼠10只,腹腔2%戊巴比妥麻醉,固定于手术台面,常规消毒腹部,铺手术洞巾,于腹中线剪开约3cm,暴露大部分肝脏,手术切除肝左中右叶约占全肝的75%,术后灌服10%葡萄糖水给予支持治疗。于肝大部分切除术后24小时,从大鼠下腔静脉采血,制备血清,-20℃冷藏备用。Wistar大鼠体重约260g,颈椎脱臼处死,置于75%酒精消毒10min。于无菌条件下取出两侧股骨,剪断两端骨骺,用L-DMEM培养液反复冲洗骨髓腔,细胞悬液1500rpm/min离心5min去除脂肪层。重悬细胞用比重为1.077g/ml的percoll分离液分离,取中间界面层,用L-DMEM培养液洗涤2次。苔盼蓝计数,将细胞以1×106/ml,密度接种于培养瓶,于37℃,5%CO2培养。48h换液除去未贴壁细胞,每3d换液1次,待细胞长到基本80%融合,以1:2传代。将生长第2代细胞以5×105/ml密度接种于96孔板,每孔100μl;第2天吸弃培养液,以含各组含药血清或肝