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第一部分携带双报告基因的慢病毒载体构建及鉴定目的:构建携带报告基因荧光素酶(luciferase2)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescenceprotein,egfp)的慢病毒载体 FUGW-Luc2-eGFP,在人源性胚胎肾细胞293T (human emborynic kidney 293T,HEK293T)中包装产生感染性的病毒粒子,对病毒粒子的感染能力进行体内检测,为后续的细胞感染及活体成像示踪奠定基础。方法:通过基因克隆操作,扩增pGL4.17载体中的荧光素酶基因(Luc2)序列,纯化后将其插入到带有eGFP序列的FUGW载体中,得到双报告载体FUGW-Luc2-eGFP。经酶切和测序鉴定后,慢病毒三质粒系统在HEK293T细胞中包装。结果:经酶切、PCR和测序实验证实成功构建了携带双报告基因的慢病毒载体FUGW-Luc2-eGFP,经包装和浓缩后病毒粒子的滴度为108IU/mL。小鼠颅内注射病毒液可见生物发光成像(bioluminescence imaging,BLI)信号,一直持续到注射后28天。双报告融合蛋白(Luc2-eGFP)与荧光素酶和eGFP结构比对提示融合蛋白不会改变eGFP的蛋白结构,也不会改变荧光素酶的活性。结论:成功构建了携带双报告基因的慢病毒载体并包装产生了具有感染能力的病毒粒子。第二部分人脐血来源内皮祖细胞的标记及双模态成像研究目的:分离、培养及鉴定脐血来源的内皮祖细胞(hEPCs)。应用携带双报告基因的病毒粒子FUGW-Luc2-eGFP和超顺磁性纳米氧化铁(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)对 hEPCs 进行双标记得到 D-hEPCs。通过生物发光成像(BLI)和磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)对标记细胞进行体外成像检测。方法:采用密度梯度离心法从新生儿脐带血中分离培养出hEPCs,从细胞形态、细胞标志分子的免疫荧光染色、细胞功能等方面对hEPCs进行鉴定。用携带双报告基因的病毒粒子(FUGW-Luc2-eGFP)和纳米粒子SPIONs对hEPCs进行双标记得到D-hEPCs,通过BLI和MRI对D-hEPCs进行成像检测。通过细胞组织学染色检测D-hEPCs,并且比较了 hEPCs和D-hEPCs中细胞周期、细胞凋亡的变化。结果:hEPCs形态呈铺路石样,细胞免疫荧光染色CD31、CD34和VEGFR2均为阳性,细胞可以结合FITC-UEA-1也可以摄取Dil-ac-LDL,体外基质胶上可以形成管状结构。通过BLI和MRI对D-hEPCs进行双模态的成像检测,可见不同细胞数目成像的信号强度不同。D-hEPCs普鲁士蓝染色中胞浆可见蓝染,细胞接近100%阳性反应,通过流式细胞检测和免疫荧光染色可见D-hEPCs中GFP的表达约为85%。通过对D-hEPCs细胞周期和细胞凋亡检测显示与hEPCs无明显差别(P>0.05)。结论:由脐血中成功分离、培养、鉴定了内皮祖细胞。携带报告基因Luc-eGFP的慢病毒粒子以及SPIONs能够高效、无损伤的双标记hEPCs,并能通过BLI和MRI实现成像监测,为后续实验的细胞治疗以及细胞的活体示踪提供可行的细胞来源。第三部分内皮祖细胞移植治疗缺血性脑卒中的研究目的:光化学法建立小鼠卒中模型,将经慢病毒感染的hEPCs (V-hEPCs)移植到卒中小鼠中,通过BLI比较经尾静脉途径与经左心室途径输注V-hEPCs在卒中小鼠中的归巢情况。在卒中小鼠中选择经左心室途径输注D-hEPCs实现BLI和MRI活体双模态示踪,并且探讨外源性的hEPCs对卒中小鼠的治疗作用。方法:用携带双报告基因的慢病毒粒子感染hEPCs得到单标记的细胞(V-hEPCs),将106个V-hEPCs分别经左心室和经尾静脉途径移植到光化学法建立的小鼠卒中模型中,通过BLI监测两种不同途径细胞移植后1, 4, 7天的归巢情况。用携带双报告基因的慢病毒粒子和SPIONs先后标记hEPCs得到双标记的细胞(D-hEPCs),在卒中小鼠中通过经左心室途径输注D-hEPCs,在细胞移植的1, 4, 7,14天进行BLI和MRI的活体示踪监测。在细胞移植前以及细胞移植后的第1,7, 14天进行神经功能评分;在细胞移植后第7天用MR T2WI扫描评价病灶大小;在细胞移植后第14天进行组织学染色检测血管新生、神经发生以及脑组织的凋亡变化。结果:BLI显示经尾静脉途径与经左心室途径输注V-hEPCs,均能够归巢到卒中小鼠的缺血脑组织,但经左心室途径输注细胞的归巢能力明显强于经尾静脉途径的移植方式,具有统计学差异(P<0.05)。通过BLI和MRI可活体示踪D-hEPCs经左心室途径在卒中小鼠中的转归,脑组织病理切片染色可见梗死灶周边有普鲁士蓝染色阳性、GFP染色阳性细胞,说明D-hEPCs的归巢于缺血组织。神经功能评分和T2扫描测定梗死灶的大小提示D-hEPCs移植能够减少卒中小鼠的行为学缺陷并且减少脑梗死灶的大小。在D-hEPCs移植组,脑组织病理切片CD31染色、DCX染色明显强于PBS对照组,而TUNEL染色弱于对照组,且均具有统计学差异(p<0.05)。结论:经左心室途径移植V-hEPCs能提高细胞归巢到缺血组织的数量。BLI和MRI活体示踪结合脑组织病理学染色证实D-hEPCs归巢于缺血梗死灶周边。D-hEPCs移植能改善卒中小鼠的行为学缺陷、减少梗死灶大小、促进梗死区域的血管新生和神经发生,降低梗死区域细胞凋亡。