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安莎霉素是一类以3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid,AHBA)为起始单元的独特的聚酮类抗生素,目前已经报道的安莎霉素类化合物共有18个骨架近300个化合物,该类化合物通常具有显著生物活性,其中代表性化合物利福霉素的衍生物是抗结核一线药物,美登木素的衍生物2013年被批准用于乳腺癌的治疗,格尔德霉素则是著名的HSP90抑制剂,由此可见这类化合物具有极高的成药潜力,因此,寻找新的安莎霉素类化合物备受天然产物化学家的青睐。前期,本实验室针对安莎霉素起始单元合成中兼具保守性和特异性的AHBA合酶基因通过PCR追踪分离与筛选获得了 80余株阳性菌,进一步的基因组序列分析从中发现了十几条可能编码新骨架安莎霉素的合成基因簇以及另外两类未知天然产物(含AHBA结构单元但不属于安莎)合成基因簇,但后续的研究表明这些新颖基因簇均处于沉默状态。本论文围绕其中的四株新颖的AHBA阳性菌(链霉菌S033、S035、S051和马杜拉放线菌S046)开展了定向挖掘工作。为了进一步使用转录激活策略进行目标基因簇的定向激活,我们需要建立这几株菌的遗传操作体系。我们首先进行了产孢条件摸索和抗生素敏感性测试,在此基础上,使用含黑色素报告基因的整合型质粒pMELK优化了孢子接合转移条件(包括接合培养基、Mg2+浓度、孢子萌子条件等),最终确立了这几株菌较优的遗传操作体系,其中链霉菌S035的接合转移效率较高,可以达到2×10-4,其余三株菌的接合转移效率较低,仅为1×10-7-10-8。链霉菌S033、S035和马杜拉放线菌S046中分别有一个安莎合成基因簇,生物信息学预测其产物均为五酮苯安莎新骨架。基因预测显示这三个基因簇中均含有苯安莎基因簇保守的 SARP(Streptomyces Antibiotic Regulatory Protein)和 LAL(Large ATP-binding regulators of the LuxR family)家族调控基因,而这两类调控基因在已知的安莎霉素合成途径中均起正调控作用,因此,我们通过对这两个调控基因进行了组成型表达和共表达。其中链霉菌S035的SARP和LAL调控基因单独过表达和共表达突变株与野生型相比,均多出了一系列差异峰,5033的SARP调控基因过表达突变株S033-SARP与野生型相比,也有差异峰出现。药学院硕士生尉飞飞对这几个突变株进行了追踪分离,从共表达突变株S035-SL中分离鉴定了aminoansamycinA-G,从LAL过表达突变株S035-LAL中分离鉴定了化合物L2,其骨架与生物信息学预测完全吻合,值得一提的是,S035-LAL与S035-SL的代谢谱差异很大,预期其中存在更多的aminoansamycin类新结构衍生物,目前对其的分离工作仍在进行中。与已知五酮安莎不同的是,活性测试显示aminoansamycin类化合物具有不错的细胞毒活性,其中aminoansamycin D和E对HeLa细胞的IC50均为 0.9 μM,aminoansamycin D 对 HCT116 的 IC50为 0.21 μM。尉飞飞对 S033 的SARP调控基因过表达突变株S033-SARP的高氏培养基发酵产物进行追踪分离,从中鉴定了一个开环的五酮安莎新骨架,其开环方式与本实验室最近报道的microansamycin I相同,推测可能具有相同的机理。由于接合转移效率低下,我们只获得了马杜拉放线菌S046的LAL过表达突变株,HPLC检测显示其与野生型的代谢谱并无明显差异,目标基因簇并未被激活。链霉菌S051中的AHBA合酶基因位于一个不含PKS基因和酰胺合酶的基因簇中,表明该基因簇的编码产物不是安莎霉素,从基因组成来看,该基因簇含有6个非典型的NRPS基因,包括AHBA合成相关基因在内的13个基因与丝裂霉素基因簇具有显著相似性,但丝裂霉素基因簇中仅含有一个NRPS基因,因此,我们推测该基因簇编码一类非常新颖的非安莎类新骨架。在该基因簇附近有一个SARP家族的调控基因,我们同样对其进行了组成型表达,突变株S051-SARP在SFM培养基上会产生大量扩散性红色物质,经鉴定为已知化合物naphthgeranine A,反转录PCR显示在野生型中nphS051基因簇几乎不表达,而在突变株中,nphS051存在显著的表达,表明SARP调控基因的组成型表达特异性地激活了nph基因簇。为了获得完整的aminoansamycin基因簇(oas)的序列,我们对链霉菌S035进行了完成图测序,结果表明S035含有一条7.6 Mb的线性染色体和一条1.4 Mb线性大质粒,使用antiSMASH4.0分别预测出29条和10条次级代谢产物合成途径,其中许多基因簇可能编码结构新颖的天然产物。结合转录组数据,我们选择其中5个基因簇尝试对可能的正调控基因进行过表达,获得了 6个突变株,其中4个突变株与野生型相比存在明显的差异峰,差异峰的产物还有待进一步的分离鉴定。综上,本研究论文通过基因组挖掘,成功激活了链霉菌S033和S035中两个沉默五酮安莎霉素生物合成基因簇,得到了两类新骨架五酮安莎霉素,证实了生物信息学分析指导的调控基因组成型表达这一挖掘策略的有效性,为其它安莎霉素等新颖天然产物的挖掘提供了参考。