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极性外排途径是真核细胞将胞内合成的重要物质靶向运输到细胞膜上(或外)的重要途径,其与真核生物细胞的生长、通信和极性建立等重要生命活动的关系十分密切。寻找极性外排途径相关新基因并揭示它们的新功能对该途径的深入研究具有重要意义。早期Novick实验曾经报道了一个筛选酿酒酵母温度敏感型分泌缺陷突变体的方法,并且发现了23个极性外排途径相关的SEC基因。但是,他当时所设定的条件只能筛选出那些37℃分泌严重受阻,密度梯度离心后明显沉入下层的突变体细胞,而忽视了分泌受阻不明显仍留在上层的突变体细胞。筛选Novick实验密度梯度离心后的上层细胞中被忽略的分泌缺陷突变体为发现新的极性外排途径相关基因提供了可行性。本实验正是以密度梯度离心后的上层突变体(Novick实验弃掉的细胞)为研究对象,成功地筛选出了在Novick实验中未曾涉及过的温度敏感型分泌缺陷突变体,并且获得了一系列可能与极性外排途径相关的新基因。目前取得的主要成果及结论如下:
1、温度敏感型分泌缺陷酵母突变体的筛选及其分泌缺陷特性的鉴定。利用EMS诱变、两次密度梯度离心、限制性温度条件筛选等技术手段成功筛选出了560余个新的温度敏感型分泌缺陷突变体。选取其中30个突变体进行热激(37℃处理1-2 h)前后胞内和胞外的Invertase及Bg12p含量比较,发现所有突变体的这两种酶都无法正常分泌到胞外去,证明我们筛选的突变体外排途径确实受阻,而37℃培养1 h后电镜观察突变体细胞,未见胞内分泌小泡的积累。
2、基因组文库挽救及挽救片段分析。对30个分泌缺陷突变体进行基因组文库挽救,获得了一批能够挽救这些突变体的基因组DNA片段,并查明了它们所在的染色体位置、长度范围及所包含的基因类别。
3、功能基因验证。从基因组DNA挽救片段上分别克隆出单个候选基因,将克隆的候选基因与组成型表达载体pRS315连接后去挽救对应的温度敏感型分泌缺陷突变体,以查明DNA挽救片段中发挥挽救作用的具体基因,排除其它基因的干扰。目前为止已验证了LCB2,CDC14,TEL2三个基因的挽救功能。
4、TEL2基因的突变位点鉴定及其翻译产物的生物信息学分析。采用高保真PCR技术从突变体基因组中克隆TEL2基因全序列,检测到两个突变位点P367→L,S545→F。应用生物信息学比较分析TEL2基因突变前后翻译产物的差异和联系,推测TEL2蛋白结构功能域在氨基酸246～434范围内。首次揭示了端粒长度调控基因TEL2在极性外排途径中的重要作用。