阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种进行性中枢神经系统退行性疾病。它是老年期痴呆最常见的一种类型[1]，以不断进展的记忆障碍、全面智能减退、个性改变以及精神行为异常为主要临床表现，是全球老年人的主要致残、致死疾病之一。随着全球人口老龄化加剧，世界各地的 AD发病率逐年上升，根据国际阿尔茨海默病协会（Alzheimers DiseaseInternational，ADI）2016年公布的数据，目前全球约有4680万AD患者，平均每3秒即新发1例；根据预测，全球阿尔茨海默病患者例数到2030年将达到7470万例，2050年将突破1亿，高达1亿3150万例[2]。2010年，ADI报告每年全球用于治疗和护理AD患者的费用超过6040亿美元[3]。目前我国AD患者估计在800万到1000万，报告指出，未来中国和世界均面临治疗和照顾数量庞大的AD患者的重负[4]。AD典型的病理特征是脑神经细胞外出现由β淀粉样蛋白（amyloidβ protein，Aβ）聚集形成的老年斑[5]，脑神经细胞内tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结及神经元原发变性、坏死[6,7]。由于目前AD的病因及发病机制尚不十分明确，治疗主要依靠口服药物治疗包括改善胆碱能神经传递的药物和抗氧化药物等进行对症治疗[8]。因药物在病灶部位聚集量有限，故尚无理想的根治效果。因此深入探讨AD发病的分子机理，发现调控AD病程的关键分子，对AD的基础研究和临床诊治意义重大。　　人源的 NDRG2基因是第四军医大学生化教研室于1999年发现并克隆[9]。NDRG2基因定位于染色体14q11.2，含有16个外显子，15个内含子，编码含有371个氨基酸残基、分子量约41kDa的蛋白[9]。Mitchelmore等发现NDRG2在AD患者脑组织中的表达显著高于对照组受试者[10]，但NDRG2表达增高究竟是参与促进AD的发展，还是在Aβ等应激反应条件下细胞启动的一种内源性保护机制并不清楚。作为一个新的细胞应激反应基因，NDRG2参与多种细胞应激反应，并且主要表达于小鼠脑组织的星形胶质细胞[11,12]。而星形胶质细胞本身又参与多种细胞应激反应，表明NDRG2在中枢神经系统重要的生理和病理反应过程中起到了不可或缺的作用[13]。　　综上，本实验旨在探究NDRG2在AD病理发展过程中的作用，为AD的预防和治疗提供更多科学依据，为药物干预和基础研究进行临床转化奠定基础。　　实验一：在AD病理进程中NDRG2的表达水平变化规律　　目的：观察在 AD病理进程中不同月龄的同窝 APP/PS1小鼠的海马区 NDRG2表达变化。　　方法：设置4组同窝APP/PS1雄性小鼠，每组3只，分别定于4个时间点取材：2月龄、5月龄、8月龄、11月龄。在相应取材时间将小鼠处死取脑，统一取左半脑做冰冻切片，进行免疫荧光染色检测NDRG2和GFAP的水平表达情况；取右半脑海马组织使用Western Blot技术检测NDRG2、GFAP和β淀粉样蛋白表达水平变化。　　结果：免疫荧光结果显示，随着月龄增加，四组小鼠海马区 NDRG2和 GFAP表达增高；与免疫荧光染色结果相对应，Western Blot检测结果显示：随着月龄增加，11月龄组小鼠海马区GFAP表达水平显著高于其他三组（P＜0.05）；四组小鼠海马区Aβ1-42蛋白水平随着鼠龄增加而显著递增（P＜0.05）；海马区NDRG2表达也随着鼠龄增加而显著递增（P＜0.05）。　　实验二：NDRG2-/-小鼠注射AβO造模后学习记忆能力检测　　目的：分别将NDRG2敲除小鼠和正常小鼠在侧脑室注射Aβ寡聚体造模后进行记忆能力检测并对比结果，观察NDRG2在AD病理进程中所起的作用。　　方法：首先将Aβ单体进行老化处理得到Aβ寡聚体(AβO)。2月龄的C57背景的雄性小鼠设置成4组，每组8只，分别对每只小鼠进行双侧侧脑室注射。第一组是野生型 C57小鼠双侧侧脑室各注射5ulAβ寡聚体;第二组是 NDRG2基因敲除（Ndrg2-/-）小鼠双侧侧脑室各注射5ul Aβ寡聚体；第三组是野生C57小鼠双侧侧脑室各注射5ul生理盐水；第四组是Ndrg2-/-小鼠双侧侧脑室各注射5ul生理盐水。注射完后将小鼠放回动物房饲养2周，然后进行三天的新事物识别的行为学实验；行为学实验完毕后处死小鼠取材，用Western Blot检测四组小鼠海马匀浆的NDRG2和β淀粉样蛋白表达水平进行造模验证。　　结果：　　1.侧脑室注射生理盐水组的NDRG2敲除小鼠在旷场试验中的运动总距离、平均速度和穿格次数显著高于其他三组小鼠（P＜0.01）。　　2.四组小鼠首次对相同物块的探索时间比率没有统计学差异；间隔1小时后对不同物块的探索时间比率，侧脑室注射生理盐水的两组小鼠对新物块探索时间显著高于侧脑室注射Aβ寡聚体的两组小鼠（P＜0.05）；间隔24小时后，对不同物块的探索时间比率上 NDRG2敲除的侧脑室注射 Aβ寡聚体组的小鼠显著低于其他三组（P＜0.01），且其他三组在新物块探索时间比率上无统计学差异。　　实验三：利用NDRG2-/-APP/PS1双基因修饰小鼠进行行为学检测　　目的：通过交配繁殖得到NDRG2敲除的AD模型小鼠，进一步验证NDRG2在AD病理进程中的作用。　　方法：用 NDRG2敲除小鼠和 APP/PS1小鼠进行交配得到 NDRG2杂合的APP/PS1子一代小鼠，然后将得到的基因型为（NDRG2+/-APP/PS1）的小鼠与NDRG2敲除小鼠回交，得到NDRG2敲除的AD小鼠模型NDRG2-/-APP/PS1。　　然后将小鼠设置成两组，第一组是NDRG2敲除的APP/PS1雄性小鼠8月龄（n=4），第二组是普通APP/PS1雄性小鼠8月龄（n=4）。将两组小鼠进行3天的新事物识别的检测并将结果进行对比。　　结果：　　1.NDRG2-/-APP/PS1小鼠组在旷场试验中的运动总距离、运动平均速度和穿格次数较APP/PS1组显著增高（P＜0.01）。　　2.两组小鼠对相同物块的探索时间比率没有统计学差异；间隔1小时后对不同物块的探索时间比率没有统计学差异；间隔24小时后对不同物块的探索时间比率， NDRG2敲除的APP/PS1组小鼠显著低于NDRG2未敲除的APP/PS1组小鼠（P＜0.05）。　　实验四：NDRG2基因缺失对AD小鼠脑中蛋白酶体功能亚基表达水平的影响　　目的：观察NDRG2对AD小鼠海马区蛋白酶体亚基表达水平的影响。　　方法：分别提取8月龄APP/PS1小鼠和NDRG2敲除的APP/PS1小鼠的海马组织RNA，运用RT-PCR的方法，检测蛋白酶体亚基PSMB5、PSMB6及PSMB7的mRNA水平。　　结果：　　与普通APP/PS1小鼠比较，NDRG2敲除的APP/PS1小鼠海马组织的PSMB6的mRNA水平显著降低(P＜0.05)，而PSMB5和PSMB7无明显变化。　　结论：　　1.在AD病理进程中，小鼠海马区的NDRG2和Aβ蛋白的表达随时间增加而增高。　　2.敲除NDRG2基因的小鼠侧脑室注射Aβ寡聚体进行AD造模后，动物长期记忆受到损伤而短期记忆没有明显变化。　　3.在经过交配繁殖得到的 NDRG2-/-APP/PS1基因型小鼠，在8月龄与普通APP/PS1小鼠相比较，长期记忆受到损伤而短期记忆没有显著差异。　　4.NDRG2的缺失降低了AD小鼠海马区蛋白酶体亚基PSMB6 mRNA的含量。小结：本实验运用Western Blot、免疫荧光染色等实验方法，表明AD病理进程中海马区NDRG2和β淀粉样蛋白的表达变化，然后运用侧脑室注射β淀粉样蛋白寡聚体构建小鼠AD模型以及通过杂交繁殖，得到NDRG2-/-APP/PS1小鼠。通过行为学检测证明在AD模型动物敲除NDRG2后，小鼠的长期学习记忆会受到损伤而短期学习记忆并没有显著差异，同时NDRG2缺失后AD小鼠蛋白酶体亚基PSMB6 mRNA的含量明显下降，提示蛋白酶体降解功能可能受损，说明NDRG2在AD神经病理损伤进程中发挥保护作用。该研究结果丰富了AD疾病的损伤机制变化内容，为AD治疗和预防的新策略提供了重要支撑。