论文部分内容阅读
研究背景和目的宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,近年来,其发病趋于年轻化。目前已知,基因改变造成的功能丧失或功能获得与癌症进展相关,如基因的突变、缺失、拷贝数畸变和染色体重排等。MicroRNA是一种单链非编码RNA,在转录后调控部分关键基因发挥作用。通过激活或抑制mRNA可调控多个靶基因表达,改变细胞的增殖、侵袭、凋亡、迁移、分化等。赖氨酸乙酰转移酶(Lysine acetyltransferases,KATs)可以乙酰化组蛋白和其他非组蛋白基质,对染色质的结构和功能至关重要。在多种癌症中,也发现了KAT6B(也称为MORF和QKF)致癌基因的染色体易位。既往研究表明,miR-487b在结直肠癌、肺癌、前列腺癌、胆囊癌、胶质瘤等癌症中的失调可促进肿瘤的生长增殖,KAT6B的抑制可以在表观遗传学上诱导细胞周期退出和细胞衰老,抑制细胞增殖。在本课题中,我们拟利用细胞生物学和分子生物学技术探索miR-487b在宫颈癌细胞中的作用及其与KAT6B的关系。研究方法及材料培养人宫颈癌细胞株Hela和C33a,首先将慢病毒包裹的miR-487b前体序列的反义序列(lv-antagomiR-487b)转染入人宫颈癌细胞,荧光及PCR检测miR-487b转染。下调miR-487b,研究miR-487b下调后对宫颈癌细胞增殖、浸润、迁移、侵袭的影响。随后,结合Internet网络免费数据库(包括TARGETSCAN、miRbase等)预测出调控miR-487b的靶基因KAT6B。再运用CRISPR/Cas9-KO方法敲除KAT6B,在此基础上,转入miR-487b前体序列或前体序列的反义序列,研究上调miR-487b或下调miR-487b后其对宫颈癌细胞增殖、迁移、浸润、侵袭的影响。实验中采用细胞连续培养并显微镜下计数以检测细胞生长情况;采用细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力;采用EdU实验检测细胞DNA复制及增殖能力;采用划痕实验检测细胞迁徙运动能力和修复能力;采用Transwell实验检测细胞迁移能力;采用Matrigel Transwell实验检测细胞侵袭能力;采用Western Blot检测蛋白表达,探索可能的信号机制。统计学处理每个细胞株的每种实验重复3次以上,且每次实验都设置3个副孔。使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,GraphPad prism 7.0软件进行图像数据整理。当P<0.05时认为有统计学意义。研究结果1.miR-487b对宫颈癌细胞生长有负调控作用。在宫颈癌细胞株中,敲低miR-487b表达后,细胞学实验可见细胞的生长速度、集落形成能力、DNA复制及增殖能力、迁徙运动和修复能力、迁移和侵袭能力均增加。2.KAT6B是miR-487b作用的靶基因。结合网络免费数据库(包括TARGETSCAN、miRbase等)预测miR-487b靶基因为KAT6B,其存在潜在miR-487b的结合位点。3.在敲除KAT6B基因的基础上,转入miR-487b前体序列或前体序列的反义序列,在细胞增殖、迁移、侵袭等实验中,发现结果同敲除KAT6B的实验结果趋势一致,无明显上述降低miR-487b表达后促进细胞生长增殖能力。4.miR-487b可能通过AMPK-AKT-mTOR信号通路,调控宫颈癌增殖、迁移、侵袭等作用。Western blot实验结果显示,miR-487b敲低后,磷酸化AMPKα水平降低,而磷酸化mTOR、AKT、S6水平增加,生长因子受体EGFR、PDGFRα、PDGFRβ表达均增加。而在敲除KAT6B的宫颈癌细胞和在敲除KAT6B基础上再上调或者下调miR-487b的宫颈癌细胞株中,则出现与上述相反结果,他们的磷酸化AMPKα水平增加,mTOR、AKT、S6的磷酸化水平减少,生长因子受体EGFR、PDGFRα、PDGFRβ表达也减少。结论1.miR-487b低表达,促进宫颈癌细胞生长、增殖、迁移和侵袭。2.miR-487b靶点是KAT6B,通过靶向结合KAT6B发挥调控宫颈癌作用。3.miR-487b通过激活AMPK-AKT-mTOR信号通路途径,调控宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭等作用。