研究目的由于1-溴丙烷(1-BP)不破坏臭氧层,被用作氟利昂类化合物替代物,为了满足需要,生产和使用量每年都在递增,随着1-BP广泛被使用,越来越多的工人接触到1-BP,接触到1-BP的工人通过皮肤和呼吸道吸收入体内,工人长期暴露于挥发的1-BP环境中,会产生一些毒性作用,比如肝脏毒性、生殖毒性以及神经系统毒性,以神经系统毒性最为明显。中枢神经系统是1-BP暴露影响最敏感的靶部位。但目前1-BP神经系统毒性的研究开展还不够,相关的职业防护措施以及中毒后的治疗措施也并未系统化,开发出治疗1-BP神经中毒的药物显得尤为重要。有机溶剂有一个共同的特点,就是易溶于脂肪,它们对神经组织有高度的亲和性,1-BP也不例外。有机溶剂中枢神经系统中毒的主要症状除了眩晕、恶心、头痛、呕吐等,长期接触的还会出现疲惫、注意力不集中、记忆力衰退、烦躁、易激怒等。但是如此多的神经系统毒性在动物身上无法重现,本研究中,我们检测各组SD大鼠学习和记忆能力通过经典的Morris水迷宫实验来进行,部分反映人中枢神经系统毒性反应,来探讨1-BP神经系统中毒的预防以及治疗。目前治疗1-BP中毒通常分为两种处理方式,一种为病因治疗,脱离1-BP环境,通常轻度1-BP中毒者,神经系统功能可以自由恢复。重症患者预后很差。另一种为药物治疗,目前1-BP中毒无特效解毒剂,主要以对症和支持治疗,严重者预后很差。1-BP中毒中CNS的改变以及学习记忆功能的异常机制尚不清楚,但研究表明,1-BP引起的神经系统毒性可能与氧化应激有关。本研究中探讨了四种抗氧化剂,以期找到治疗1-BP中毒引起学习记忆障碍的治疗药物,褪黑激素可以通过抗氧化以及抑制脂质的过氧化反应避免细胞结构、DNA不受损伤,同时降低体内过氧化物的含量；银杏叶提取物(EGb)有效成分为黄酮类和内酯类,其主要成分具有协同抗氧化,清除自由基,改善脑血循环,提高记忆力以及改善认知功能；大蒜油的价值不仅局限于食品和保健品,还有很多药用价值,具有抑制细菌、真菌、病毒,降血压、降血脂、抑制血小板聚集、清除自由基等多种功效；大蒜素被誉为天然光谱抗生素,大蒜素还有其独特的药理学活性,可抗肿瘤、降低胆固醇、抗血小板聚集、降血压、降血脂、抗衰老及记忆力下降等。筛选出1-BP中毒的治疗药物,为以后探讨其作用机制以利于用于临床做好初步研究。本实验中,采用灌胃给予1-溴丙烷,并延长给予1-溴丙烷的时间,更好模拟临床长期暴露1-溴丙烷导致中枢神经系统损伤出现的学习记忆损伤情况,研究四种不同的抗氧化剂对1-BP引起中枢神经系损伤导致学习记忆功能障碍的作用,以褪黑素为代表,采用不同剂量褪黑素对600mg/kg 1-BP染毒的SD大鼠用Morris水迷宫试验对各组大鼠的学习记忆能力进行评价,并分别通过氧化抗氧化指标、HO-1蛋白表达情况、病理形态学等指标初步探讨褪黑素改善1-BP染毒导致的神经系统功能障碍的机制,为1-BP中毒的治疗打下理论基础。研究方法1 1-溴丙烷引起中枢神经系统损伤模型的建立48只雄性SD大鼠,预饲养5天后,按体重随机分为玉米油对照组、1-BP(200mg/kg bw)组、1-BP (400mg/kg bw)组、1-BP (600mg/kg bw)组,每组12只。每天给药1次,连续给药27天。给药量通过最近测定的体重进行计算,给药容量为2 mL/kg。给药1、4、7、 10、 13、16、 19、22、27天称量大鼠体重,并统计1-7、7-14、 14-21天每只大鼠平均摄食量情况。其中随机选取10只大鼠从22天开始通过Morris水迷宫试验对大鼠的学习和记忆能力进行评价,第22天作为训练日,不计入统计,23-26天为定位航行试验,27天进行空间探索实验。每组部分动物通过腹腔注射30%乌拉坦进行麻醉后,心脏灌注预冷的生理盐水和4%多聚甲醛,小心取出大脑将其置于4%多聚甲醛中备用,并做冰冻切片、石蜡切片,对大鼠海马进行形态学观察。本研究通过行为学指标和病理两方面评价1-溴丙烷导致中枢神经系统损伤引起学习记忆障碍模型是否成功。2四种抗氧化剂对1-溴丙烷引起中枢神经系统损伤的干预研究60只雄性SD大鼠,预饲养5天后,按体重随机分为6组,分别为玉米油组、1-溴丙烷组(600mg/kg/day)、褪黑素(腹腔注射10mg/kg/day)+1-溴丙烷组,银杏叶提取物(灌胃100mg/kg/day)+1-溴丙烷组,大蒜素(灌胃60mg/kg/day)+1-溴丙烷组、大蒜油(灌胃60mg/kg/day)+1-溴丙烷组,连续21天,每天染毒1-BP前1小时给予供试品,其中褪黑素干预组一般在6：00pm给药,第22天开始用Morris水迷宫试验对大鼠的学习和记忆情况进行测试,第22天作为训练日,不计入统计,23-26天为定位航行试验,27天进行空间探索实验。本研究对四种抗氧化剂对1-BP导致的神经系统学习障碍的干预情况进行考察。3褪黑素对1-溴丙烷引起中枢神经系统损伤保护作用及机制研究90只雄性SD大鼠,预饲养5天后,按体重随机分为6组,每组15只,分别为玉米油组、1-溴丙烷组(600mg/kg/day)、褪黑素对照组(腹腔注射10mg/kg/day)、褪黑素(腹腔注射2.5mg/kg/day)+1-溴丙烷组、褪黑素(腹腔注射5mg/kg/day)+1-溴丙烷组、褪黑素(腹腔注射10mg/kg/day)+1-溴丙烷组,连续21天,每天染毒1-BP前1-2小时给予供试品,其中褪黑素干预组一般在6：00pm给药[1],第22天开始进行Morris水迷宫试验来测定大鼠的学习和记忆情况,22天为训练日,不计入统计,23-26天为定位航行试验,27天进行空间探索实验,实验结束后,每组随机取10只大鼠用过量的苯巴比妥钠麻醉,处死,小心取出大脑,并分离海马、皮层以及小脑,快速置于液氮中速冻,转移至-80℃冰箱贮存备用。每组剩余5只动物通过腹腔注射30%乌拉坦进行麻醉后,心脏灌注预冷生理盐水和4%多聚甲醛后,小心取出大脑将其置于4%多聚甲醛中备用。通过Morris水迷宫考察褪黑素对1-BP导致的中枢神经系统损伤引起的学习记忆情况,并用生化法检测海马中GSH、GSSG、MDA、H2O2的含量和SOD酶活性,免疫组化方法考察海马CA3区神经元的变化,并用TUNEL试剂盒检测神经元减少的原因,采用western blotting检测动物海马中HO-1蛋白的表达,观察其变化情况。研究结果1 1-溴丙烷引起中枢神经系统损伤模型研究1.1 Morris水迷宫评价1-BP染毒对SD大鼠空间学习记忆能力的影响Morris水迷宫实验中,与玉米油对照组相比,1-BP低剂量组(200mg/kg)、1-BP中剂量组(400mg/kg)、1-BP剂量组(600mg/kg) SD大鼠逃避潜伏期和游泳距离明显延长,平台穿越次数和目标象限百分比明显降低,各组之间存在着差异,尤其以1-BP高剂量(600mg/kg)表现最为明显。提示1-BP能够明显损伤实验动物的学习记忆能力。1.2病理形态学考察与学习记忆有关的海马神经元形态学变化通过琉瑾染色和HE染色观察1-BP对学习记忆关键部位的海马的影响,实验结果显示,1-BP可以明显使得海马CA1和CA3区细胞数减少,排列不规则,细胞出现空泡,深染,细胞核皱缩,细胞间隙变大。2四种抗氧化剂对1-溴丙烷引起中枢神经系统损伤的干预研究在定位航行试验中,随实验天数的增加,各组动物每天的逃避潜伏期和游泳总路程基本呈递减趋势逐渐变短,游泳速度在各组间未见差异。补充褪黑素、大蒜素、大蒜油均能减轻1-BP导致的SD大鼠学习能力下降,补充银杏叶提取物改善1-BP致学习能力降低效果不明显。在四种抗氧化剂中,褪黑素效果最为显著。四种抗氧化剂都能不同程度的对1-BP引起的空间学习能力有所保护,其中褪黑素表现最为明显。与1-BP组相比,褪黑素干预组显著增加大鼠的平台穿越次数,在平台所在的目标象限时间百分比也显著增长；大蒜素和大蒜油干预组同样起到类似的效果,而银杏叶提取物干预组未有显著变化。此结果表明褪黑素、大蒜素、大蒜油均对1-BP染毒SD大鼠空间记忆能力有改善作用,且效果显著。综合定位航行实验和空间探索实验结果,褪黑素、大蒜素、大蒜油均可以改善1-BP导致的SD大鼠学习记忆障碍(中枢神经系统损伤),褪黑素最为明显。3褪黑素对1-溴丙烷引起中枢神经系统损伤保护作用及机制研究3.1褪黑素对1-BP导致SD大鼠认知功能的改善作用Morris水迷宫实验结果显示,通过SD大鼠逃避潜伏期和游泳距离可以看出,褪黑素能够剂量依赖性的改善1-BP导致的SD大鼠学习能力损伤,高剂量最为明显。褪黑素中、高剂量干预组显著增加SD大鼠穿越平台次数,褪黑素高剂量干预组显著增加SD大鼠目标象限百分比时间,此结果表明褪黑素能剂量依赖性的改善1-BP染毒SD大鼠导致的空间记忆能力障碍,且高剂量组效果显著。3.2褪黑素可以显著增加SD大鼠海马组织中的GSH含量以及GSH/GSSG的比值不同剂量的褪黑素可以缓解对GSH的损耗,与1-BP染毒组相比,褪黑素高剂量干预组显著的提高GSH含量达163.6%之多,差异具有统计学意义。与1-BP染毒组相比,褪黑素高剂量干预组可以显著升高GSH/GSSG比值。3.3褪黑素可以显著降低SD大鼠海马组织中MDA和H202水平,并且可以上调SOD活性与1-BP染毒组相比,给予褪黑素干预后,不同剂量的褪黑素表现出了一定的抗氧化作用,其中在MDA水平上,与1-BP染毒组相比,褪黑素中、高剂量干预组明显降低MDA分别为36%和44%,且具有统计学差异。在过氧化氢这个指标上,与1-BP染毒组相比,褪黑素剂量依赖性的降低过氧化氢水平,低、中、高剂量褪黑素干预组分别降低了21%、22%、36%,虽没有明显剂量依赖性,但都具有统计学差异。而在抗氧化酶超氧化物歧化酶指标上,与1-BP染毒组比较,中、高剂量褪黑素干预组明显提高,分别提高了23%和33%,且都具有统计学差异。3.4海马中GSH/GSSG比值和MDA与认知功能的具有很好的相关性通过Spearman秩相关相关性分析得知,SD大鼠认知功能损伤与海马中GSH/GSSG比值降低呈正相关关系,与MDA水平升高呈负相关关系。3.5褪黑素改善1-BP造成大鼠海马CA3区神经元数目的减少玉米油对照组大鼠海马CA3区神经元完整、边缘清晰,细胞排列整齐,细胞排列紧密,细胞层较多。1-BP染毒组大鼠海马CA3区神经元边缘不清,细胞间隙变大,排列疏松,有大量的神经元缺失。褪黑素高剂量干预组(10mg/kg bw)组大鼠CA3区神经元与玉米油对照组比较相似。这表明褪黑素可以改善1-BP造成大鼠海马CA3区神经元数量的减少。3.6褪黑素可以改善1-BP导致海马神经元的凋亡玉米油对照组大鼠海马神经元未见深染的紫蓝色细胞,而1-BP染毒组可见大量的TUNEL标记的紫蓝色阳性神经细胞,褪黑素高剂量干预组(1Omg/kg bw)和玉米油对照组极为相似,未见显著差异。3.7褪黑素降低1-BP染毒引起的大鼠海马HO-1含量升高与1-BP染毒组相比,不同剂量的褪黑素能剂量依赖性的使大鼠海马中的HO-1含量下降。结论1.1-BP可以引起SD大鼠中枢神经系统损伤,可能与学习记忆密切相关的海马CA3神经元凋亡有关。2.褪黑素、大蒜素、大蒜油均可以改善1-BP导致的中枢神经系统损伤,在本实验条件下,褪黑素最为明显。3.1-BP可以使SD大鼠海马组织中GSH、GSH/GSSG比值、以及SOD水平降低,可以使MDA和H2O2升高,褪黑素能拮抗这些氧化应激水平,维护体内氧化抗氧化平衡。4.1-BP可以引起HO-1含量的增高,可能是机体受到氧化应激后的保护性防御机制的启动,褪黑素可以降低大鼠海马组织中的HO-1含量,保护机体免受氧化应激的损伤。