【研究背景】原发性肝细胞肿瘤是常见的恶性肿瘤性疾病,严重影响着人类的健康。大约有90%以上的原发性肝肿瘤是肝细胞癌(HCC)。肝细胞癌的发生是一个复杂的过程,它由环境因素和基因因素共同作用。乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、酒精和黄曲霉毒素B1等多种因素参与肝细胞损伤后,诱发肝细胞异常坏死和增生,还可以通过理化因素刺激诱导体细胞发生抑癌基因的失活和原癌基因的激活,综合诱导肝细胞恶性转化的过程,最终会导致慢性肝病,肝硬化,形成肝细胞癌(HCC)。在中国,肝癌发生的病因多为乙肝病毒感染。中国的乙肝病毒感染人群占总人口的比例已超过了8%,约为1.12亿。乙型肝炎病毒HBV是环状双链DNA分子,HBx基因序列是乙型肝炎病毒基因组中四个开放阅读框之一,其编码的HBx蛋白是一种反式激活因子。HBx蛋白是HBV促进肝细胞恶性转化的关键蛋白,其可以通过以下几个方面,如激活Notch、PI3K/m TOR和Wnt/β-catenin pathway,影响非编码RNA(lnc RNAs和miRNAs)调控下游信号,改变表观遗传学(甲基化和乙酰化),影响DNA修复,氧化应激和改变免疫系统等来引起正常肝细胞恶性转化,促进肝细胞癌的发生和发展。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类发挥重要功能的内源性非编码单链RNA,编码长度约为19~25个核苷酸分子,通过与靶基因的3’-UTR结合发挥作用。miRNA通过调节细胞内蛋白的转录等多种方式促进正常细胞的恶性转化进程。本课题组前期研究发现,在正常肺上皮细胞株中,人为失活miR-100可协同增强重金属污染物——砷通过活化细胞的上皮-间质转化作用促进恶性转化的发生。同样还有文献报道,miR-34a可以通过协同EGFR酪氨酸激酶抑制剂杀伤非小细胞肺癌肿瘤细胞。在本课题关注的正常肝细胞的恶性转化中,前期研究发现了体外失活HL02细胞内的miR-100可以促进细胞株恶性生物学功能,导致正常细胞的恶性转化。基于以上背景知识,我们猜想miR-100失活在HBx致肝细胞恶性转化中是否具有协同促进作用,进而导致肝癌的发生?根据假设,在本课题中我们将HBx慢病毒转染到人正常肝细胞(HL02)以及miR-100失活的HL02中,并筛选出稳定细胞株。通过观察不同干预因素处理的细胞的生物学功能以及相应细胞在裸鼠体内形成肿瘤的功能来探究miR-100失活在HBx致肝细胞恶性转化的作用,并对其可能参与的信号通路及关键分子做进一步的机制研究。【研究方法】1.在正常肝上皮细胞HL02以及miR-100失活的HL02细胞中,使用HBx过表达慢病毒,转染并筛选出HBx过表达、miR-100失活联合HBx过表达共转染细胞株。2.通过MTT,平板克隆,细胞迁移和侵袭实验,软琼脂集落形成实验,来探究不同干预因素对于正常肝细胞HL02生物学行为变化的影响。3.裸鼠成瘤实验检测不同干预因素对于正常肝细胞HL02裸鼠成瘤能力的影响。4.使用western blot检测ERK/AKT/m TOR信号通路变化,使用RT-PCR检测相关细胞因子的表达。【实验研究结果】(1)成功转染并筛选出HBx过表达、miR-100失活联合HBx过表达共转染细胞株。(2)HBx过表达促进了HL02细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力、集落形成能力,诱导了HL02细胞的恶性转化。(3)miR-100失活协同促进了HBx过表达的HL02细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力、集落形成能力以及裸鼠成瘤能力。(4)miR-100失活协同促进了HBx过表达的HL02细胞的ERK/AKT/m TOR激活,并影响了IL-6的表达。【结论】miR-100失活在HBx致肝细胞恶性转化中具有协同促进作用