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长春碱、长春新碱是临床应用最广泛的天然植物抗肿瘤药物,但在长春花植物体中含量很低,因此人们设想通过组织和细胞培养生产长春碱、长春新碱。目前实现这一设想的主要障碍在于培养细胞不能或极少合成长春碱、长春新碱的重要前体——文多灵。本文主要研究长春花细胞C20hi中文多灵、长春质碱等生物碱的生物合成与诱导调控,并克隆了一个与文多灵合成相关基因t16h(水甘草碱16-羟化酶基因)有较高同源性的cyp71d1基因,探讨该基因表达与文多灵等生物碱合成的相关性。
结果如下：
1.克隆了cyp71d1的cDNA全长并分析了其转录表达特点。结果显示：
①cyp71d1的cDNA全长1801bp,编码一个507个氨基酸的P450蛋白。前端27个氨基酸构成疏水性的由外向内的内质网膜锚定结构,推测CYP71D1可能是结合于内质网膜内侧的结合蛋白。CYP71D1与其它CYP71D亚家族成员在氨基酸水平上有39％-56％的同源性。
②cyp71d1在长春花激素自养细胞系C20hi中表达量最高,在C20中的表达量最低。2,4-D和KT都能抑制该基因的表达,其中2,4-D的抑制作用更强。
③在成熟的长春花植株中,cyp71d1的转录在花瓣、根、茎、嫩叶中依次递减,其在嫩叶中的表达量仅为花中的1/6。cyp71d1在老叶中没有表达。
2.建立了长春花细胞生物碱提取与UPLC-MS同时检测文多灵、蛇根碱、阿玛碱、长春质碱的方法。该方法灵敏度高,能够检测样品中0.5 ng·g-1的生物碱；分析速度快,整个分析时间为6 min。该方法采用Acquity UPLC(R)BEH C18柱(2.1×50 mm,1.7μm,Waters,Ireland),色谱条件为流速：0.3 mL·min-1;柱温：45℃；进样量：2μl;流动相：乙腈(A)和0.1％甲酸水溶液(B),洗脱程序如下：0～0.5 min,20％A;0.5～3.5 min,20-35％A;3.5～4.5 min,35～80％A：4.5～6.0 min为平衡时间,20％A。定量分析采用选择离子监测模式(SIM),ESI系统条件气动辅助电喷雾参数设置如下:Capillary Voltage：3 kV;Cone Voltage：35 v;ExtractorVoltage：3 v;Source Temprature：120℃；Desolution Temprature：350℃；Desolution gas Flow(N2)：550L/hr:Cone gas Flow(N2)：50 L/hr:ESI+Mode Scan。
3.通过UPLC-MS比较了C20hi与C20D细胞合成阿玛碱、蛇根碱、文多灵和长春质碱的能力。发现两种细胞都能稳定合成文多灵和蛇根碱,其中C20hi细胞合成这两种生物碱的能力显著高于C20D(P<0.01,配对T-检验)。两种细胞也都能合成长春质碱和阿玛碱,但含量很低且不稳定,可能受到培养条件或细胞生活状态的影响。
4.研究了三种诱导子——光照、茉莉酸甲酯(MeJA)、酵母提取物(YE)对C20hi细胞生物碱合成与相关基因表达的影响。结果显示:
①光照不是t16h、d4h基因表达和文多灵生物合成的必要条件。但光照可显著促进文多灵合成相关基因t16h(水甘草碱16-羟化酶基因)、d4h(脱乙酰氧基文多灵4-羟化酶基因)的转录,显著促进文多灵生物合成。50μM MeJA可诱导t16h表达,对d4h转录没有明显促进作用。光照与MeJA联合诱导对文多灵生物合成具有显著的协同促进作用(P<0.001)。0.5 mL的YE处理对d4h的转录无显著促进作用,对t16h砌的转录则有抑制作用。YE诱导对细胞文多灵生物合成没有显著促进作用。
②光照对str(异胡豆苷合成酶基因)表达无影响,MeJA和YE可诱导str的转录。光照对C20hi合成蛇根碱没有显著影响。MeJA可促进蛇根碱积累。MeJA与光照联合诱导可显著促进蛇根碱的积累(P<0.05,配对T-检验)。其中50μM MeJA与光照联合诱导可使蛇根碱产量提高98.6％。YE诱导可使蛇根碱产量平均提高49.8％,但不具有统计学上的显著性差异。
③光照、MeJA和YE对C20hi细胞合成长春质碱和阿玛碱没有显著影响。
④光照、MeJA对C20hi细胞中cyp71d1的表达没有影响,YE可能抑制cyp71d1的表达。
5.根据CYP71D1氨基酸序列同源比对结果及诱导表达特点探讨了其功能及与生物碱生物合成的相关性。推测CYP71D1可能是一种羟化酶,底物可能含有一个环己烷、环己烯或苯环结构,羟基化作用发生在底物的己烷环、己烯环或苯环上。根据2,4-D抑制cyp71d1基因表达分析,CYP71D1可能与C20hi的激素自养有关,因C20hi比2,4-D依赖的C20D细胞具有更强的生物碱合成能力,推测CYP71D1可能参与C20hi的吲哚生物碱合成。至于CYP71D1是否参与文多灵生物合成途径目前无法推定,需要更深入的实验结果来佐证。
6.本研究的主要创新点在于用UPLC-MS方法检测到长春花细胞中文多灵的生物合成,探讨了悬浮培养细胞合成文多灵的调控机制。结果显示,去分化的长春花细胞能够合成文多灵,不需要分化形成特殊的乳汁管细胞和异细胞。光照不是文多灵生物合成的必要条件,但能显著促进细胞中文多灵生物合成及相关基因表达。光照与MeJA联合诱导可协同促进C20hi细胞中文多灵的生物合成。